SSR分析的原理及操作技术报告.ppt

SSRSSR分析的原理及操作技分析的原理及操作技术报告术报告DNA分子标记技术类型分子标记技术类型§以以SouthernSouthern杂交为基础的分子标记技术：杂交为基础的分子标记技术：限制性内切酶片段长度多态性标记（限制性内切酶片段长度多态性标记（RFLPRFLP））§以以PCRPCR为基础的分子标记技术：为基础的分子标记技术：随机引物随机引物PCRPCR标记标记和和特异引物特异引物PCRPCR标记标记随机扩增多态性随机扩增多态性DNADNA（（RAPDRAPD））扩增的限制性内切酶片段长度多态性（扩增的限制性内切酶片段长度多态性（AFLPAFLP））相关序列扩增多态性（相关序列扩增多态性（SRAPSRAP））简单重复序列（简单重复序列（SSRSSR）或简单序列长度多态性（）或简单序列长度多态性（SSLPSSLP））§以以mRNAmRNA为基础的分子标记技术：为基础的分子标记技术：差异显示（差异显示（DDDD））逆转录逆转录PCRPCR（（RTRT－－PCRPCR））§以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术：以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术：单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNPSNP））SSR简介简介§在生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，在生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，根据重复序列在基因组中的分布形式可分为：根据重复序列在基因组中的分布形式可分为：串联重复序列串联重复序列（（Tandemly repeated sequencesTandemly repeated sequences））分散重复序列（分散重复序列（Interspersed repeated sequencesInterspersed repeated sequences）） §依据重复基序的依据重复基序的长度长度、、拷贝数拷贝数和和位置位置等又将串联等又将串联 重复序列分为：重复序列分为：卫星卫星DNADNA：基序（：基序（motifmotif）长）长1010～～300bp300bp，甚至长，甚至长1,0001,000～～100,000bp100,000bp；；小卫星小卫星DNADNA：基序长：基序长1010～～60bp60bp；；微卫星微卫星DNADNA：基序长：基序长1 1～～6bp6bp，其，其功能：功能：重组热点、对基因的调节和表达以重组热点、对基因的调节和表达以及性别决定等。

及性别决定等SSR简介简介§微卫星微卫星DNADNA即即简单重复序列简单重复序列（（simple sequence repeatsimple sequence repeat，，SSRSSR），），或者或者微卫星序列微卫星序列（（microsatellitemicrosatellite，，MSMS），），又称又称短串联重复短串联重复（（short tandem repeatsshort tandem repeats，，STRSTR），），是一类由几个核苷酸（多为是一类由几个核苷酸（多为2 2～～4 4个）为基本单位个）为基本单位多次串联重复而多次串联重复而形成的形成的DNADNA片段，其长度一般较短，多在片段，其长度一般较短，多在200bp200bp以内 §微卫星在植物基因组中的含量非常丰富，均匀分布于整个植物微卫星在植物基因组中的含量非常丰富，均匀分布于整个植物基基因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化非常大，但因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化非常大，但（（ATAT））n n最多SSR标记的基本原理标记的基本原理§尽管微卫星尽管微卫星DNADNA分布于整个基因组中的不同位置，但某分布于整个基因组中的不同位置，但某一特定的微卫星的两端一特定的微卫星的两端侧翼序列侧翼序列通常都是通常都是保守性较强的保守性较强的单一序列单一序列，，将重复序列及其两侧的将重复序列及其两侧的DNADNA片段进行片段进行克隆克隆和和测序测序，然后根据两端的侧翼序列，然后根据两端的侧翼序列设计一对特异引设计一对特异引物物，通过，通过PCRPCR技术将目的微卫星技术将目的微卫星DNADNA片段扩增出来片段扩增出来。

SSR标记的基本原理标记的基本原理§由于单个微卫星位点的由于单个微卫星位点的重复单元在数量上的不同重复单元在数量上的不同，导致扩，导致扩增产物在长度上发生变化，即产生长度多态性，这种多态增产物在长度上发生变化，即产生长度多态性，这种多态性称为性称为简单序列长度多态性简单序列长度多态性( (simple sequence length polymorphism，，SSLP) )，每一扩增位点就代表了该位点的，每一扩增位点就代表了该位点的一对等位基因一对等位基因§SSR标记的多态性主要依赖于基本单位重复次数的变异，标记的多态性主要依赖于基本单位重复次数的变异，而这种变异在生物群体中是大量存在的，因此，而这种变异在生物群体中是大量存在的，因此，SSR具有具有大量的等位差异，多态性十分丰富大量的等位差异，多态性十分丰富PCR技术的基本原理技术的基本原理§聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reactionpolymerase chain reaction，，PCRPCR）是）是利用单链寡核苷酸引物对特异利用单链寡核苷酸引物对特异DNADNA片段进行体外快速扩增的片段进行体外快速扩增的一种方法。

一种方法特点一：使特定的特点一：使特定的DNADNA片段得到了迅速大量的扩增，理片段得到了迅速大量的扩增，理论上的最高值达论上的最高值达2 2n-2n-2；；特点二：能够指导特定特点二：能够指导特定DNADNA片段的合成片段的合成§如何实现？如何实现？PCR反应体系反应体系§一对特异引物：一对特异引物：§1.引物长度引物长度：典型的引物长度为：典型的引物长度为18-24bp，引物需要足够长，保证序列，引物需要足够长，保证序列独特性但是长度大于独特性但是长度大于24bp的引物并不意味着更高的特异性较长的序的引物并不意味着更高的特异性较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量；从而降低了产量；§2.引物浓度引物浓度：一般：一般0.1-0.5  mol/L，过高的引物浓度会加剧错配发生，特，过高的引物浓度会加剧错配发生，特异性下降；异性下降；§3.合理的合理的G/C含量含量：一般为：一般为40％～％～60％PCR反应体系反应体系§Mg2＋＋溶液溶液￿ ￿：其浓度直接影响引物：其浓度直接影响引物退火的特异性退火的特异性、、产物特异性产物特异性以及以及酶的酶的催化能力和准确性催化能力和准确性等，适当降低等，适当降低Mg2＋＋浓度可增加特异性。

浓度可增加特异性§模板模板DNA：一般：一般1ng/1µL，模板浓度过高会导致反应的非特异性增加；，模板浓度过高会导致反应的非特异性增加；§dNTP ：常用浓度为：常用浓度为50-200 mol/L，种，种dNTP浓度应相等，浓度过高易浓度应相等，浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量§Taq酶酶￿ ￿：：DNA聚合酶，热稳定，最适温度聚合酶，热稳定，最适温度72 ℃℃，酶量增加使反应特异，酶量增加使反应特异性下降性下降;酶量过少影响反应产量酶量过少影响反应产量￿ ￿§10××buffer缓冲液（不含缓冲液（不含Mg2＋＋￿ ￿）：维持）：维持PCR￿ ￿pH的稳定PCR循环条件循环条件§高温变性：双链高温变性：双链DNA模板加热变性成单链；模板加热变性成单链；￿ ￿§低温退火低温退火：在低温下引物与单链：在低温下引物与单链DNA互补配对；互补配对；          ￿ ￿退火温度针对不同的引物差别较大，退火温度过低，极易形成非特退火温度针对不同的引物差别较大，退火温度过低，极易形成非特异扩增，而退火温度过高，又难以扩增出条带，对于长度为异扩增，而退火温度过高，又难以扩增出条带，对于长度为20bp，，GC含量为含量为50％的核苷酸的典型引物，％的核苷酸的典型引物，55 ℃℃是比较适宜的退火温度。

是比较适宜的退火温度§适温延伸：在适宜温度下适温延伸：在适宜温度下Taq DNA酶催化引物沿着模板酶催化引物沿着模板DNA延伸PCR条件优化条件优化§优化引物设计：这是最关键的，可以借助计算机来辅助设优化引物设计：这是最关键的，可以借助计算机来辅助设计引物§热启动技术：在热启动技术：在PCR反应的第一个循环中待温度升高且超反应的第一个循环中待温度升高且超过模板过模板Tm值（值（80℃℃）后，再加入关键试剂如）后，再加入关键试剂如Taq DNA聚合聚合酶等这样操作可以减少非特异性扩增这样操作可以减少非特异性扩增§创造一个有利于增加特异性扩增的条件：如创造一个有利于增加特异性扩增的条件：如降低降低Mg2＋＋，，dNTP浓度浓度，，优化优化pH及及减少减少Taq酶的用量酶的用量，，减少循环中各部减少循环中各部分的时间或循环数分的时间或循环数，，提高退火温度提高退火温度等电泳原理电泳原理§在生理条件下，核酸分子之糖－磷酸骨架中的磷酸基团，在生理条件下，核酸分子之糖－磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的当核酸分子被放置在电场中时，他们是呈离子化状态的当核酸分子被放置在电场中时，他们就会向就会向正电极正电极的方向迁移。

的方向迁移§在一定的电场强度下，在一定的电场强度下，DNADNA分子的这种迁移速度，亦即电泳分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型分子量较的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型分子量较小的小的DNADNA分子，比分子量较大的分子，比分子量较大的DNADNA分子，具有较紧密的构分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率较快型，所以其电泳迁移率较快电泳介质电泳介质§琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶§聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 优点：优点：① ① 分辨率极高分辨率极高，可分开长度仅相差，可分开长度仅相差0.10.1％的％的DNADNA分子，即分子，即 1000bp1000bp中相差中相差1bp1bp；；②②从聚丙烯酰胺凝胶中从聚丙烯酰胺凝胶中回收的回收的DNADNA纯度很高纯度很高，可用于要求，可用于要求最高的实验最高的实验聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶§聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺丙烯酰胺单体，在催化剂单体，在催化剂TEMEDTEMED(N,N,N,N(N,N,N,N’一四甲基乙二胺一四甲基乙二胺) )和和过硫酸铵过硫酸铵的作用下，的作用下，聚合形成线状长链，在交联剂如聚合形成线状长链，在交联剂如N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺参与参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的链与链之间交叉联接而形下的共聚合反应中，聚丙烯胺的链与链之间交叉联接而形成三维带状网络结构的凝胶。

成三维带状网络结构的凝胶§这些网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂这些网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶§变性聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶 用于用于单链单链DNADNA片断的分离与纯化这些凝胶在片断的分离与纯化这些凝胶在尿素尿素或或甲酰胺甲酰胺等等抑制核抑制核酸碱基配对酸碱基配对的试剂的存在下发生聚合变性的的试剂的存在下发生聚合变性的DNADNA在这些凝胶中的迁移在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关率几乎与其碱基组成及序列完全无关§非变性聚丙烯酰胺凝胶非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于用于双链双链DNADNA片段的分离和纯化双链片段的分离和纯化双链DNADNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率通常与其大小的常用对数值成反比然而，电泳迁移率也受其的迁移率通常与其大小的常用对数值成反比然而，电泳迁移率也受其碱基组成和序列的影响，因此，大小完全相同的两条碱基组成和序列的影响，因此，大小完全相同的两条DNADNA的迁移率可相的迁移率可相差差1010％非变性聚丙烯酰胺凝胶主要用于％。

非变性聚丙烯酰胺凝胶主要用于制备高纯度的制备高纯度的DNADNA片段片段和和检测检测蛋白质－蛋白质－DNADNA复合物复合物 ￿ ￿用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测时，通用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测时，通常常PCR产物在产物在变性聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶上分离效果上分离效果优优于非变性胶因为杂合个体在于非变性胶因为杂合个体在PCR后期的循环中后期的循环中会产生异源双链分子，导致在杂合的情况下胶中产会产生异源双链分子，导致在杂合的情况下胶中产生了生了3条带甚至是条带甚至是4条带，而不是正常的条带，而不是正常的2条带这种情况出现会干扰等位基因的统计种情况出现会干扰等位基因的统计染色方法与原理染色方法与原理§溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）染色法：）染色法：但是聚丙烯酰胺对荧光燃料溴化乙锭但是聚丙烯酰胺对荧光燃料溴化乙锭的荧光有猝灭作用，的荧光有猝灭作用，EBEB染色法很难检测到少于染色法很难检测到少于10ng10ng的的DNADNA条带§银染法（硝酸银）：银染法（硝酸银）：是一种检测微量是一种检测微量DNADNA的理想方法的理想方法优点：经济、简便、快速、灵敏，无污染、分辨率高、结果可永优点：经济、简便、快速、灵敏，无污染、分辨率高、结果可永久保存久保存原理：银染液中的原理：银染液中的银离子银离子(Ag+)(Ag+)可与可与DNADNA形成稳定的复合物，然后用形成稳定的复合物，然后用还原剂如还原剂如甲醛甲醛在在碱性条件碱性条件下使下使Ag+Ag+还原成银颗粒，可把还原成银颗粒，可把DNADNA电泳带电泳带染色成黑褐色染色成黑褐色载样缓冲液（载样缓冲液（loading buffer））指示剂（溴酚蓝或二甲苯氰）一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖指示剂（溴酚蓝或二甲苯氰）一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400等组成载等组成载样缓冲液，加入到扩增好的样缓冲液，加入到扩增好的PCR产物当中。

产物当中作用作用：：1.增加样品密度，使其比重增加，以确保增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内均匀沉入加样孔内2.形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置3.使样品呈色，使加样操作更方便使样品呈色，使加样操作更方便实验方法与步骤实验方法与步骤1.1.实验材料实验材料§马贵荔（母本）马贵荔（母本）××焦核三月红（父本）焦核三月红（父本）F1F1杂种群体中部分个杂种群体中部分个体的基因组体的基因组DNADNA溶液每人做溶液每人做4 4个模板§一对特异引物：一对特异引物：B-F09 FB-F09 F：：5’TCTGCTTACCAGCATGAGTGA 3’5’TCTGCTTACCAGCATGAGTGA 3’B-F09 RB-F09 R：：5’CTGTTGGTCTGCAGGTTTTG 3’5’CTGTTGGTCTGCAGGTTTTG 3’2.2.配制配制SSRSSR扩增的反应液：扩增的反应液：§各组份的用量及终浓度如下表，做多个反应时，可将所用的的相同组份各组份的用量及终浓度如下表，做多个反应时，可将所用的的相同组份一次取样、混匀后再分装至各个反应中。

一次取样、混匀后再分装至各个反应中组分组分1 1个反应体积个反应体积终浓度终浓度4 4个反应体积个反应体积ddHddH2 2O O10.210.2µL L40.840.8µL L1010××bufferbuffer缓冲液缓冲液（含（含15mM Mg15mM Mg＋＋））2.02.0µL L1 1××8 8µL L2.5mM dNTP2.5mM dNTP1.61.6µL L0.2mM0.2mM6.46.4µL L5 5µM M 引物引物F F1.01.0µL L0.25µM0.25µM4 4µL L5 5µM M 引物引物R R1.01.0µL L0.25µM0.25µM4 4µL L模板模板DNADNA（（5ng/5ng/µL L））4 4µL L1ng/µL1ng/µLTaqTaq酶（酶（5U/5U/µL L））0.20.2µL L1U1U0.80.8µL L总体积总体积2020µL L8080µL L3.SSR-PCR3.SSR-PCR配制好反应液后，放入配制好反应液后，放入PCRPCR仪中进行扩增反应，扩增程序为：仪中进行扩增反应，扩增程序为：9494℃ ℃ 3min3min（预变性）；（预变性）；9494℃ ℃ 50s50s→→5555℃ ℃ 50s50s→→7272℃℃50s50s（（3535个循环）；个循环）；7272℃℃ 10min 10min（延伸反应）（延伸反应）4.4.制备制备5 5％的变性聚丙烯酰胺凝胶：％的变性聚丙烯酰胺凝胶：§将长、短玻璃板固定在制胶板上，用将长、短玻璃板固定在制胶板上，用1.01.0％的琼脂糖封口，将配好的％的琼脂糖封口，将配好的胶溶液沿玻璃板点样端小心灌入，排除气泡，待胶灌满后插入梳子，胶溶液沿玻璃板点样端小心灌入，排除气泡，待胶灌满后插入梳子，静置静置1h1h，让其聚合凝固。

让其聚合凝固5 5％变性胶％变性胶100ml100ml尿素尿素 （（UreaUrea））42g42g5 5××TBE bufferTBE buffer20ml20ml4040％丙稀酰胺％丙稀酰胺12.5ml12.5ml1010％过硫酸铵％过硫酸铵400400µl lTEMEDTEMED87.587.5µl l4040％丙稀酰胺溶液（％丙稀酰胺溶液（1919：：1 1））100ml100ml丙稀酰胺（丙稀酰胺（AcrylamideAcrylamide））38g38g甲义甲义- -丙稀酰胺（丙稀酰胺（Bis-AcrylamideBis-Acrylamide））2g2g5.5.电泳样品的准备：电泳样品的准备：在在PCRPCR产物中加入产物中加入8 8µL L的的loadingloading bufferbuffer混合，得到混合，得到混合物，混合物，9595℃℃加热加热3min3min，迅速置于冰上冷却，然后点样迅速置于冰上冷却，然后点样6.6.电泳：电泳：每个点样孔中，点加适量的混合物（每个点样孔中，点加适量的混合物（4 4µL L），每排梳孔中最左边），每排梳孔中最左边的梳孔用于点加的梳孔用于点加DNA MarkerDNA Marker（分子量标记物），以便计算分子量，以（分子量标记物），以便计算分子量，以300V300V电压进行恒压电泳，电泳液为电压进行恒压电泳，电泳液为0.5×TBE0.5×TBE，待溴酚蓝条带泳动至胶，待溴酚蓝条带泳动至胶板底端时停止电泳。

板底端时停止电泳LoadingbufferLoadingbuffer组分组分用量用量9898％％FormamideFormamide（甲酰胺）（甲酰胺）49ml49ml（（100100％）％）10MmEDTA10MmEDTA（（pH8.0pH8.0））1ml1ml（（0.5M0.5M，，pH8.0pH8.0））0.250.25％％Bromophenol BlueBromophenol Blue（溴酚蓝）（溴酚蓝）0.125g0.125g7.7.染色染色步骤步骤试剂试剂漂洗漂洗30s30sddHddH2 2O O染色染色8min8min0.10.1％硝酸银％硝酸银400ml400ml漂洗漂洗30s30sddHddH2 2O O显色显色4min4min8g NaOH8g NaOH，，2ml 372ml 37％甲醛，％甲醛，0.1g0.1g四硼酸四硼酸钠定容至钠定容至500ml500ml漂洗漂洗ddHddH2 2O O8.8.观察观察§记录父母本及记录父母本及F1F1代的带型，供进一步的分代的带型，供进一步的分析用结束结束。