动物细胞工程动物细胞重组技术与克隆技术.ppt

细胞工程,动物细胞重组技术与克隆技术,第一节 细胞重组技术的概论 第二节 细胞重组技术的重要应用克隆技术,第一节 细胞重组技术的概论,一、细胞重组技术的定义 细胞重组技术又被称为细胞拆合技术，就是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞的一种实验技术过程 细胞的生长过程包含着细胞器的自我装配，这是一种活体的自我装配，而细胞重组则是离体的装配过程 真核细胞的细胞核和细胞质相互配套、精确平衡1.2.3亲本细胞 4.6核体 5.7胞质体 8杂交细胞 9核杂种细胞 10重组细胞 11胞质杂种细胞 PEG介导的细胞融合技术 培养基筛选,几种可能的细胞（重组）拆合方式,几个重要的概念,胞质体（Cytoplast）：除去细胞核后由膜包裹的无核细胞，由细胞松弛素处理后，经离心得到 核体（Karyoplast）：与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜的结构 核杂种细胞：将一个亲本细胞的核体与另一个完整的亲本细胞进行融合，所得到的杂种细胞 胞质杂种细胞：将一个亲本细胞的胞质体与另一完整的亲本细胞的进行融合，所得到的杂种细胞。

重组细胞：将一个亲本细胞的核体与另一个亲本细胞的胞质体融合 杂交细胞：两个完整的亲本细胞间的融合细胞融合范畴）,二、细胞重组的基本方式 一般而言，细胞重组的方式基本分为以下三种 胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种细胞 胞质体与核体重新组合形成重组细胞 微细胞（微核体）与完整细胞重组形成微细胞异核体 其中，第2种方式是最为重要的细胞重组技术 三、细胞重组的技术基础 细胞操作技术（细胞分离技术1；细胞核质分离技术2） 动物细胞融合技术3 （有膜细胞成分的融合重组） 显微操作技术4（细胞内物质的抽取和移植；物质向细胞的注入）,1. 细胞分离技术,细胞分离的依据 细胞的大小 细胞的密度 细胞表面电荷 细胞表面标志物 细胞对其他介质的吸附作用 细胞分离常用方法 等密度沉降分离法（根据细胞密度） 流式细胞仪分离法（根据细胞表面标志物或细胞表面荷电情况） 磁分选技术,原理 操作时，先配制一定浓度的梯度介质，然后加入细胞溶液中，在选定得离心力作用下，不同密度的细胞处于离心介质的密度范围内或向下沉降，或向上漂浮，当移动至其密度与介质密度相等的位置（等密度点）便不再移动，形成静止区带，即达到离心平衡，各组分按密度不同处于区带的不同位置，然后，这些不同位置的细胞分开收集，就能达到彼此分离的目的离心技术。

密度梯度介质 梯度介质具有足够大的溶解度，以形成所需的密度浓度范围；不会与样品中的组分发生反应；也不会引起样品中组分的凝集、变形或失活 氯化铯（CsCl）和Ficoll（多聚蔗糖）等等密度沉降分离法分离细胞,等密度沉降分离法的操作方法,人外周血细胞,实例 用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC） Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，疏水性高，平均分子量为400，000，当密度为1.2gml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜 常用来分离人PBMC的分层液比重是 1.0770.001 的 聚蔗糖-泛影葡胺分层液 红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞用滴管沿管壁加入抗凝处理的静脉血与密度介质（分层液）的上层,水平2000rpm离心离心20min分层,用毛细血管取出位于分层液表面的单个核细胞,流式细胞仪及其分选细胞原理 主要由4部分组成：细胞流动系统及气压流速控制系统，激光系统，检测与讯号处理系统，细胞分选系统。

其主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定 当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴，每小滴内最多含一个细胞； 细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型； 如识别的是预计所需的细胞时（如T细胞、B细胞要其亚群），在细胞样品流断裂成小滴时，使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷，使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管； 用FACS分离细胞准确快速，能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行，但仪器昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研究的手段流式细胞仪分选细胞,前向角散（FSC）,侧向角散（SSC）,流式细胞仪分选细胞的基本方式,利用磁分选技术分离目的细胞,2. 细胞核质分离技术,A.胞质体的制备 1960s，卡特发现用细胞松弛素B处理体外培养细胞能诱发细胞排核；普雷斯科特借助细胞松弛素B的这种作用，结合高速离心得到了胞质体 制备胞质体需在灭菌恒温培养室中进行适宜的温度、细胞松弛素B的剂量、培养液浓度及其血清含量、离心速度、细胞密度等因素都是获得纯度大、得率高的胞质体至关重要的因素。

胞质体内虽不像有核细胞那样具有完整的DNA复制，但线粒体内自主性的DNA复制尚能有限进行着蛋白质的合成，在去核后的一段时间内持续进行 B.核体的制备 上述与胞质分离得到的带有少量胞质并围有质膜的细胞核就是核体； 为了大量生产核体，必须采用一系列的纯化技术（反复贴壁/离心，核体贴壁率大大低于残留的完整细胞） ，以防夹杂完整细胞和胞质体C.微细胞与微细胞的制备 微细胞的定义微细胞（或称为微核体）是指含有一条或几条染色体（即只含一部分基因组），外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体这种细胞只能存活几个小时微细胞的制备方法 用化学药剂（如秋水仙素）阻断供体细胞的有丝分裂，使染色体停滞在有丝分裂中期； 然后经体外培养，在单个染色体或染色体周围就会重现核膜； 再用细胞松弛素B处理，促使细胞排核，就能得到含有一个微核、一个薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞2. 细胞核质分离技术,3. 利用动物细胞融合技术进行细胞成分的重组,融合,筛选,重组细胞,胞质杂种,微细胞异核体,3. 显微操作技术,是一项十分精细的细胞操作技术，是目前细胞重组的必备技术；不仅可以重组细胞成分，而且也是细胞重组原材料的获得新方法。

起源于用微细管吸细菌并把它移植到培养基上 需要显微操作仪： 用微细玻璃针或者用微吸管、微电极、微热电偶等斜插入细胞中去，可以挑去细胞核，人工造就去核细胞（胞质体）和核体； 也可以将吸有核体微吸管斜插入细胞中，将核体注入细胞内相应位置，完成细胞重组的核移植； 还能够完整细胞的各组分解剖四、三种细胞重组基本方法的实践意义 A.胞质杂种 胞质杂种细胞是不同种系之间的一种真正的新型细胞，在适宜的条件下能成功的生存下去，它在物种的品种改良、医学及农业的各个方面将产生重大的影响； 胞质杂种细胞对于研究去核细胞质体的作用具有重要的意义 B.微细胞异核体 微细胞异核体的制备提供了一种新颖有效的基因转移技术，被称为微细胞介导的基因转移法； 微细胞导入的基因只有一条或若干条染色体，能够提高异核体的基因组整合效率，并且能够用于研究供体的特定基因功能； C.重组细胞 能够完整无性杂交、能过实现生物体的无性繁殖； 是一种最为重要的细胞重组技术五、细胞重组技术的价值 细胞重组技术是现代生物工程中令人瞩目的热点课题之一 细胞重组技术将细胞融合技术和胞质分离等技术相结合，为重新构建不同类型的杂种细胞提供了可能； 细胞重组技术使动物无性繁殖成为可能； 细胞重组技术结合基因转移技术可以人为地使细胞表达新性状和产生新产物。

六、细胞重组技术的发展趋势 细胞器重组 细胞重建 体内已经存在的某种物质，可以由细胞质，甚至细胞外的某种基质为基地，通过自组织、自装配过程，一步步地形成完整的细胞细胞重建的概念是我国贝时璋院士提出的；,第二节 动物细胞重组技术的重要应用动物克隆技术,一、什么是克隆？ “克隆（clone）”一词来源于希腊语，原意是用于扦插的枝条，也就是指无性繁殖本意是遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体； 最初是指在微生物实验中，通过平板培养所获得的一个个菌落（细菌克隆）； 随着分子生物学的发展，随着基因工程与核移植技术的出现；现在，克隆一词已不再指一般意义上的无性繁殖，而是指一种实现无性繁殖的操作； 基因工程中，可以将某一被选定的目标基因拼接到质粒的复制子上，随着复制子的复制也能可到DNA分子的无性系，于是把此操作也称为克隆； 细胞工程中，通过核移植操作可以得到重组细胞，重组细胞可以繁殖成一个无性系，也称为克隆二、利用动物细胞重组技术进行动物克隆的理论基础？ 细胞的全能性 已经分化了和尚未分化的细胞具有发育成完整有机体的各种组织的潜在能力的性质 细胞的全能性与细胞机能的特化 微生物等单细胞生物的细胞保持了“全能”,细胞各种技能稳定； 而高等生物细胞则牺牲“全能”，而提高某种功能的效率，细胞出现分化，但是任何一个细胞都还含有其生物体基因组的全部基因，因此都能被克隆。

植物细胞易于克隆，用一个胡萝卜细胞在试管中培养，能长成了一株具有根、茎、叶等器官的完整植株，由此开发的植物的组织培养，证明了植物细胞全能性； “动物胚胎的生长、分化和发育是否造成体细胞基因组的不可逆性修饰？”；1930s，斯佩尔曼提出“分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎的发育？”；早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体胚胎细胞具有全能性；“多利”羊的克隆出世高度分化的动物细胞核仍具有全能性三、克隆动物的技术方法细胞核移植技术 主要是以显微操作为基础的细胞核移植为核心技术的无性繁殖操作技术细胞核移植技术主要包括以下一些要点： 核供体和受体细胞的准备（供体细胞可以是囊胚细胞或成体细胞；受体细胞可以是未受精的卵母细胞或是受精卵） 受体去卵核（采用显微操作技术，用微细管吸取卵核和第二极体；早期的两栖类动物的克隆，也使用紫外照射法去卵核） 供体细胞制备（发育至囊胚期的胚胎或器官的单个细胞进行短期培养，采用“饥饿技术”迫使细胞处于某种休眠状态，保证核供体和受体细胞处于同样的细胞周期） 核移植（用微细管吸取供体细胞的核体以及周围的少量细胞质，一起注射入去核后的受体细胞中；微细管应比细胞核大，比供体细胞小；操作应注意刺入的位置、深度和力度，以及操作实践和温度）,受体体细胞的选择、制备及核的植入,四、克隆动物的技术路线 Step1：核受体动物的选择与细胞核的移出 Step2：核供体动物的选择与细胞核的获得 Step3：供体核的移入及激活 Step4：胚泡的体外试管培养 Step5：代孕母体的选择与胚泡（桑椹期至囊胚期）移入子宫 Step6：克隆动物的体内发育及出生,克隆动物的方法根据不同来源的供体细胞核移植来实现，有胚胎细胞、干细胞、成纤维细胞和成体细胞等。

胚胎细胞克隆的应用最普遍 体细胞克隆的意义最大1. 胚胎细胞核移植法进行哺乳动物克隆,基本原理 哺乳动物的早期胚胎细胞具有全能性，早期胚胎的所有分裂球都含有与受精卵完全相同的遗传信息，具有发育成个体的全能性； 将早期分化的胚胎细胞核移植到成熟的卵母细胞中，可因其中特殊因子的作用，使植入核的基因表达被重新编排或调整，使其回到受精时的状态，从而恢复全能性；,基本技术 胚胎分割技术 细胞核移植技术,胚胎细胞核移植法克隆小鼠,2. 成体细胞核移植法进行哺乳动物克隆,体细胞克隆技术就是将动物体细胞经过抑制培养,使其处于休眠状态,利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞,发育成胚胎后移植至受体,妊娠产仔,克隆出成体动物 1950s，利用体细胞克隆成体蛙； 1997，英格兰爱丁堡罗斯林研究所和PPL制药公司的胚胎学家维尔穆特博士，以高度分化的乳腺上皮细胞为核供体，采用核移植技术，生产出了克隆羊“多莉”； 1998，美国夏威夷大学宣布从成年老鼠细胞中克隆出三代老鼠共50只，采用的克隆方法被称为檀香山技术基本技术 核供体细胞的“饥饿法”培养，恢复全能性 细胞核移植技术,核供体：芬兰多塞特白绵羊。