细胞工程课件：第四章 植物的细胞培养 3.ppt

第四章 植物细胞培养本章主要内容本章主要内容 单细胞的分离与培养单细胞的分离与培养 悬浮细胞培养悬浮细胞培养  植物细胞培养的应用植物细胞培养的应用第一节、单细胞的分离与培养第一节、单细胞的分离与培养一、分离单细胞的方法一、分离单细胞的方法 1、物理方法 2、化学方法 3、酶法 1、物理方法、物理方法 将疏松的愈伤组织放入液体培养基中，经摇摇床不断振动，使细胞分散床不断振动，使细胞分散若向细胞悬浮液中吹入脉冲压缩气体，细胞分散的更好 2、化学方法、化学方法 是在细胞悬浮培养中加入草酸盐加入草酸盐（能结合细胞间质中果胶钙的钙离子 ）、秋水仙素秋水仙素（0.1mmol/L）或2,4-D或水解乳蛋白水解乳蛋白（对细胞分散有一定的作用）3、酶法、酶法 利用果胶酶和纤维素酶果胶酶和纤维素酶使细胞分离二、单细胞的培养方法二、单细胞的培养方法 平板培养平板培养 看护培养看护培养 液体浅层培养液体浅层培养 微室培养（微滴培养）微室培养（微滴培养） 1、平板培养、平板培养定义： 将一定量细胞接种到或混合到接种到或混合到装有一薄层固体培养基固体培养基的培养皿内进行培养的方法。

技术要点： 单细胞悬浮液的制备：先过滤细胞悬浮液，去掉全部组织块和大的细胞团，获得含单细胞或4-6个的细胞团的悬浮液 调节细胞密度； 固体培养基的制备； 接种细胞：把单细胞悬浮液转移到琼脂平板上，铺成大约1mm的薄层，然后观察细胞植板率植板率植板率：它以能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示优点：便于定点观察；缺点：通气性较差植板率(％)＝形成的细胞团数接种的细胞数×100％2、看护培养看护培养 1953年Muir创立；定义定义：是指用一块：是指用一块活跃生长活跃生长的愈伤组织来的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法；种培养方法；具体方法具体方法：将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织上培养此法适用于此法适用于难于培养难于培养的植物种类的植物种类 优点优点：：简便、成功率高简便、成功率高缺点缺点：：不能在显微镜不能在显微镜下直接观察下直接观察3、液体浅层培养 技术技术：先将细胞制成一定密度的细胞悬浮液，用吸管将悬浮液移到培养皿中形成浅层，一般1mm左右，石蜡膜封口，静置培养。

优点：、培养物与空气接触面大，通气性好； 、细胞代谢产物容易扩散，不会造成有害 物质的危害； 、继代培养方便、便于观察缺点：由于细胞可以游动，不能进行定点观察 4、、 优点：可以连续观察连续观察细胞的分化和发育； 缺点：通气性差，水分难保持，pH易变动 5 、悬浮细胞培养： 将细胞接种于液体培养基中培养 （单独讲解）第二节、悬浮细胞培养第二节、悬浮细胞培养  悬浮培养(suspension culture): 是指将单个游离细胞或小细胞团单个游离细胞或小细胞团在液体培养基液体培养基中进行培养增殖的技术一、悬浮培养的过程：一、悬浮培养的过程：二、悬浮培养的优点二、悬浮培养的优点： 一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善改善 营养供应营养供应； 二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有有害物质害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害； 三是振荡培养可以适当改善气体的交换改善气体的交换；三、悬浮培养过程中细胞生长情况分析三、悬浮培养过程中细胞生长情况分析测定方法测定方法：1、细胞计数：单位体积细胞浓度；2、细胞体积：培养物离心后测定细胞层所占的体积；3、细胞鲜重或干重：过滤或干燥后称重四、悬浮细胞培养的同步化方法四、悬浮细胞培养的同步化方法（一）物理方法（一）物理方法（二）化学方法（二）化学方法1、、体积选择法体积选择法：将培养细胞经过一定大小的：将培养细胞经过一定大小的筛网过滤，对细胞按大小分别进行收集。

筛网过滤，对细胞按大小分别进行收集2、、冷处理法冷处理法：先收集细胞，后在低温（一般：先收集细胞，后在低温（一般为为4度）下处理一定时间后加培养液培养度）下处理一定时间后加培养液培养一）物理方法（一）物理方法1、、饥饿法饥饿法：控制营养使细胞处于饥饿状态，：控制营养使细胞处于饥饿状态，后加营养培养；后加营养培养；2、、有丝分裂抑制法有丝分裂抑制法：向培养液中加入化学抑：向培养液中加入化学抑制剂抑制细胞分裂，包括尿苷、秋水仙素制剂抑制细胞分裂，包括尿苷、秋水仙素（二）化学方法（二）化学方法五、一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足五、一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：三个条件： 悬浮培养物悬浮培养物分散性分散性良好，细胞团较小；良好，细胞团较小； 均一性均一性好，细胞形状和细胞团大小大致好，细胞形状和细胞团大小大致相同；相同； 细胞细胞生长迅速生长迅速（（2 2～～3 3天加倍）天加倍）六、悬浮细胞培养方法六、悬浮细胞培养方法  分批培养法分批培养法  半连续培养法半连续培养法  连续培养法连续培养法  分批培养法分批培养法： ● 是一种封闭的培养体系，培养过程中不放出培养液，也不补加培养液； ● 培养方法：旋转培养；往返培养；旋转振动；搅动培养； 在培养过程中，每隔一定时间更换一部分培养液或添加某种营养成分。

 半连续培养法半连续培养法  连续培养法连续培养法 通过控制连续添加和排出的新老营养液的量，维持培养液体积恒定，据操作的不同又可分为封闭式和开放式封闭式和开放式两种●封闭式：封闭式：回收流出的细胞于培养系统中，细胞数目增加●开放式：开放式：流出的细胞不回收于培养系统 中，但进行细胞收获七、影响悬浮细胞生长的因素： 起始愈伤组织的质量； 接种细胞密度； 培养条件：方式、温度； 继代周期八、细胞的保存继代培养保存法： 细胞定期继代培养，常用；低温保存法： 5－10度温度下培养并定期更换培养液；冰冻保存法： 分为低温保存（－20度）和超低温保存（液氮保存）第三节、植物细胞培养的应用 植物细胞含有人类所需的成分，包括初生代谢物（初生代谢物（蛋白质、碳水化合物、脂肪蛋白质、碳水化合物、脂肪等）和等）和次生代谢物次生代谢物（多酚类、香精油、生（多酚类、香精油、生物碱、树脂等），传统提取分离这些物质物碱、树脂等），传统提取分离这些物质由于资源短缺和需求量的加大，难以满足由于资源短缺和需求量的加大，难以满足需求，通过细胞培养生产植物产品成为解需求，通过细胞培养生产植物产品成为解决的有效途径。

决的有效途径 （一）、细胞培养的主产品（一）、细胞培养的主产品1、、药用代谢产物药用代谢产物 生物碱生物碱（吡啶、喹啉）、蛋白质类蛋白质类（氨基酸、植物抗生素、）、酚类化合物酚类化合物（黄酮类、单酚类、醌类）、萜类化合物萜类化合物（三萜皂甙、甾体皂甙、单萜、倍半萜、二萜）等豆杉细胞紫杉醇紫杉醇（抗癌药物）紫草细胞紫草宁紫草宁（烧伤、痔疮）例子：2、、天然食品、食品添加剂天然食品、食品添加剂 色素（胡萝卜素、叶黄素、单宁）、甜味剂（甜菊苷）、香料物质、饮料（可可碱、咖啡碱）等；3、、杀虫剂、杀菌剂杀虫剂、杀菌剂 万寿菊细胞中获得农药噻吩烷；鹰嘴豆细胞中得到除虫菊脂；香草细胞中分离到鱼藤酮杀虫剂等；4、、饲料、精细化工产品饲料、精细化工产品桑细胞培养养蚕饲料银胶菌细胞培养橡胶（二）、细胞培养技术的优点（二）、细胞培养技术的优点1、培养细胞是在、培养细胞是在无菌条件无菌条件下生长的下生长的,不受地不受地 区、季节和气候限制；区、季节和气候限制；2、占地面积少；、占地面积少；3、天然产物的生产在、天然产物的生产在控制的条件下控制的条件下进行进行,可可 以得到超越整体植物产量的代谢产物；以得到超越整体植物产量的代谢产物；4、能够产生原植物所没有的，甚至是至今在、能够产生原植物所没有的，甚至是至今在自然界还没有的化合物。

自然界还没有的化合物（三）、植物细胞生物反应器（三）、植物细胞生物反应器 生物反应器的特点生物反应器的特点： 在可控制条件下（物理和化学），在可控制条件下（物理和化学），细细胞得到大规模培养（胞得到大规模培养（工作体积大），而且工作体积大），而且单位体积生产能力高单位体积生产能力高1、植物细胞培养特性 细胞本身的特性 细胞培养液的流变特性 培养过程的气体传递与影响 泡沫与器壁表面黏附性 细胞分裂与愈伤组织的形成 悬浮细胞分批培养生长特点（（1）、细胞本身的特性）、细胞本身的特性 细胞体积比微生物细胞大细胞大（10－200µm）,是微生物细胞的30－100倍； 植物细胞生长速度慢生长速度慢； 植物细胞壁易受机械剪切力的影响易受机械剪切力的影响； 细胞常以非均相集合细胞团的方式非均相集合细胞团的方式生长（（2）、细胞培养液的流变特性）、细胞培养液的流变特性 体现在两方面： 首先，细胞培养中易结团 其次，细胞培养过程中易产生黏多糖等物质，降低传氧速度，影响细胞生长3）、培养过程的气体传递与影响）、培养过程的气体传递与影响 植物细胞培养需通过光合作用，植物细胞都好氧，因此培养过程需注意o2和co2的供应及比例关系。

（（4）、泡沫与器壁表面黏附性：）、泡沫与器壁表面黏附性：  植物细胞在培养过程中易分泌黏多糖、蛋白质等物质导致黏度增大；  植物培养过程中易产生大量气泡 对策： 利用利用消泡剂消泡剂和在器皿表面和在器皿表面涂抹硅油涂抹硅油（（5）、细胞分裂与愈伤组织的形成）、细胞分裂与愈伤组织的形成 单个细胞3－5天内可观察到细胞分裂，根据培养的目的不同选取策略： 快繁种苗快繁种苗：细胞分裂长成小细胞团后形成小愈伤组织块，然后转到分化培养基上培养； 生产细胞代谢产物生产细胞代谢产物：分散细胞团，保持细胞分裂（（6）、悬浮细胞分批培养生长特点）、悬浮细胞分批培养生长特点 延迟期：也叫适应期，细胞很少分裂 对数生长期：细胞开始分裂，并以几何级数增加 减缓期：细胞分裂减速 静止期（稳定期）：生成的和死亡的细胞数目达到平衡，总数不变 衰亡期：细胞加快死亡2、生物反应器培养过程：、生物反应器培养过程：1）、细胞的驯化、筛选与）、细胞的驯化、筛选与细胞株细胞株的建立的建立 愈伤组织的诱导与培养 单细胞的分离（机械或酶解法） 细胞无性系的分离（过滤涂板培养） 细胞株的筛选（选疏松长势好的细胞 株，并测定细胞代谢物含量） 生长速度快；生长速度快；  目的代谢产物含量高；目的代谢产物含量高；  适合悬浮细胞培养。

适合悬浮细胞培养适合大规模培养的适合大规模培养的细胞株应具备何条件细胞株应具备何条件？？2）、扩大培养）、扩大培养 逐级放大，用作培养的种子； 细胞株鉴定：经常鉴定，防止细胞株退化和变异3）、生物反应器培养）、生物反应器培养  培养方式同微生物，可以是分批培养、半连续培养、连续培养2、影响生物反应器细胞培养的主要因素、影响生物反应器细胞培养的主要因素1）、细胞遗传特性）、细胞遗传特性 取材部位、细胞株的选择2）、培养的环境条件）、培养的环境条件 主要因素包括光照、温度、搅拌与混合、通气、营养盐、pH、调节因子植物中的干细胞植物中的干细胞植物中的干细胞植物中的干细胞3、生物反应器培养系统、生物反应器培养系统 悬浮培养系统悬浮培养系统 固定化培养系统固定化培养系统1）、悬浮培养系统）、悬浮培养系统 类型类型 溶氧溶氧 破坏性破坏性 混合度混合度 限制因素限制因素气升搅拌式气升搅拌式 高高 低低 均匀均匀 细胞浓度高时有死角细胞浓度高时有死角机械搅拌式机械搅拌式 中中 强强 较均匀较均匀 细胞浓度高时混合不匀细胞浓度高时混合不匀鼓泡式鼓泡式 中中 低低 不均匀不均匀 有死角，发生细胞沉降有死角，发生细胞沉降悬浮培养系统悬浮培养系统机械搅拌式机械搅拌式气升搅拌式气升搅拌式2）、固定化培养系统）、固定化培养系统   特点：细胞固定而培养液循环流动特点：细胞固定而培养液循环流动  按照其按照其支持物不同支持物不同可以分为两大类：可以分为两大类： A A、、包埋式包埋式固定化培养系统：琼脂、琼固定化培养系统：琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺；脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺； B B、、附着式附着式固定化培养系统：尼龙网、固定化培养系统：尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维。

聚氨酯泡沫、中空纤维常见的几种固定化培养系统常见的几种固定化培养系统流化床生物反应器流化床生物反应器： 细胞包裹在胶粒、泡沫颗粒中，通入空气使固定化细胞悬浮于反应器中；填充床生物反应器：填充床生物反应器： 细胞固定在胶粒、泡沫颗粒或连续的多个网中，细胞固定不动通过流动的培养液传质；膜生物反应器：膜生物反应器： 常见的是中空纤维和螺线式卷绕反应器，传质效率低，易阻塞，产物收获较困难，投资大流化床生物反应器流化床生物反应器填充床生物反应器填充床生物反应器膜生物反应器－－－中空纤膜生物反应器－－－中空纤维维思考：固定化有思考：固定化有何优势？何优势？(1)(1)固相细胞接触紧密固相细胞接触紧密, ,生长缓慢生长缓慢, ,细胞拟组织细胞拟组织 化化, ,有利于次生产物的积累；有利于次生产物的积累；(2)(2)细胞包埋在聚合物中得到保护，可以减少细胞包埋在聚合物中得到保护，可以减少 剪切力的损伤作用；剪切力的损伤作用；(3)(3)易于把细胞与培养液分开，更有利连续培易于把细胞与培养液分开，更有利连续培 养及生物转化过程的实现；养及生物转化过程的实现； 固定化细胞培养的优点：固定化细胞培养的优点：(4)(4)高密度的细胞群体，可建立细胞间的物理、化高密度的细胞群体，可建立细胞间的物理、化学联系，细胞位置的相对固定，有利于物化梯度的学联系，细胞位置的相对固定，有利于物化梯度的建立，更有利于产物的合成建立，更有利于产物的合成; ;(5)(5)环境条件易于控制，次生代谢物易于释放。

环境条件易于控制，次生代谢物易于释放存在的问题：存在的问题：a a 产物释放产物释放 b b 氧、养分传递氧、养分传递染色法： 如用二乙酸荧光素（FDA）：活细胞活细胞能吸收并降解产生荧光，死亡细胞则无此现象呼吸强度测定法：采用氧电极法测定；细胞生长速率的测定：对细胞数量或重量进行测定 固定化细胞活力的测定：固定化细胞活力的测定：1 1、两步培养技术、两步培养技术二、提高天然产物代谢新技术二、提高天然产物代谢新技术19771977年年ZenkZenk提出：提出：(1)(1)维持培养基维持培养基(maintenance media)(maintenance media) ——尽可能快的使细胞量增长尽可能快的使细胞量增长(2)(2)生产培养基生产培养基(production media)(production media)——诱发和保持次生代谢旺盛，积累相应代谢产物诱发和保持次生代谢旺盛，积累相应代谢产物2 2、固定化培养技术、固定化培养技术 应用淀粉、琼脂、琼脂糖、藻酸钠、聚应用淀粉、琼脂、琼脂糖、藻酸钠、聚丙烯酰胺等作载体，将细胞固定在珠状胶丙烯酰胺等作载体，将细胞固定在珠状胶囊或各种形状的支持物上。

囊或各种形状的支持物上 在培养体系中加入在培养体系中加入脂溶性脂溶性有机物，或有机物，或是具有吸附作用的多聚化合物（如大孔树是具有吸附作用的多聚化合物（如大孔树脂等），脂等），使培养体系形成上、下两相使培养体系形成上、下两相，细，细胞在水相中生长和合成次生物质，次生物胞在水相中生长和合成次生物质，次生物质分泌出来转到有机相中质分泌出来转到有机相中 3 3 两相培养技术两相培养技术(1) (1) 定义：定义： a a 添加的有机物添加的有机物无毒害无毒害作用作用 b b 产物产物溶于有机物溶于有机物或被其吸收或被其吸收 c c 两相易分离，有利于产物回收两相易分离，有利于产物回收 d d 有机物等不吸收培养基中的有效成分有机物等不吸收培养基中的有效成分(2) (2) 前提条件：前提条件：(1)(1)诱导剂：诱导剂：  可引起代谢途径改变或代谢强度改变的物质可引起代谢途径改变或代谢强度改变的物质 无机离子、真菌提取液、葡聚糖等无机离子、真菌提取液、葡聚糖等  作用机理作用机理: : 可以调节代谢进程某些可以调节代谢进程某些酶的活性酶的活性, ,并对某些关键酶并对某些关键酶在转录水平上进行调节。

在转录水平上进行调节4 4 加入诱导剂及前体物加入诱导剂及前体物作用：作用：消除关键酶的阻碍、阻断内源性中消除关键酶的阻碍、阻断内源性中 间体的分隔和有效贮存，大大提高次间体的分隔和有效贮存，大大提高次 生代谢物的产量生代谢物的产量2)(2)前体物前体物烟草：烟草：天仙子胺天仙子胺 尼古丁产量降低尼古丁产量降低 新烟碱含量大大提高新烟碱含量大大提高植物细胞培养存在的问题植物细胞培养存在的问题（一）、技术问题（一）、技术问题：  细胞生长缓慢，长时间的培养对无菌要求高  细胞培养过程中易聚集，且对机械剪切力敏感；  培养的细胞易发生变异；  细胞的放大培养问题未得到充分解决二）、经济问题：（二）、经济问题： 生产成本过高，限制了其发展细胞培养的发展趋势细胞培养的发展趋势 高效细胞株系的筛选 适合大规模培养的生物反应器的开发 培养基的开发 细胞生长与培养条件等基础研究。