重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶(新增).doc

重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶Chongzu Niu Jianxing Chengxianwei Xibao Shengzhangyinzi NingjiaoRecombinant Bovine Basic Fibroblast Growth Factor Gel本品系由高效表达牛碱性成纤维细胞生长因子基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后，加入凝胶基质制成含适宜稳定剂、防腐剂，不含抗生素1.基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合现行版《中国药典》三部“凡例”的有关要求2 制造2.1 工程菌菌种2.1.1名称及来源重组牛碱性成纤维细胞生长因子工程菌株系由带有牛碱性成纤维细胞生长因子基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株2.1.2 种子批建立应符合 “生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定2.1.3 菌种检定主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定2.1.3.1 划种LB琼脂平板应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长2.1.3.2染色镜检应为典型的革兰氏阴性杆菌2.1.3.3 对抗生素的抗性应与原始菌种相符2.1.3.4 电镜检查（工作种子批可免做）应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。

2.1.3.5 生化反应应符合大肠杆菌生物学性状2.1.3.6 牛碱性成纤维细胞生长因子表达量在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量2.1.3.7 质粒检查该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符2.1.3.8目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做）目的基因核苷酸序列应与批准序列相符2.2 原液制备2.2.1 种子液制备将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基（可含适量抗生素）中培养，供发酵罐接种用2.2.2 发酵用培养基采用适宜的不含抗生素的培养基2.2.3 种子液接种及发酵培养在灭菌培养基中接种适量种子液在适宜温度下进行发酵，应采用经批准的发酵工艺，并确定相应的发酵条件，如温度、PH值、溶氧、补料、发酵时间等2.2.4 发酵液处理用适宜的方法处理菌体2.2.5 纯化采用经批准的纯化工艺进行纯化，使其达到3.1项要求，即为牛碱性成纤维细胞生长因子原液加入稳定剂，除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期2.2.6 原液检定按3.1项进行2．3 半成品制备采用的基质应符合凝胶剂基质要求（附录I M）2.3.1配制与除菌应按经批准的配方进行2.3.2凝胶制备应按经批准的工艺进行。

凝胶剂应均匀、细腻，在常温时保持胶状，不干涸或液化2.3.3半成品检定按3.2项进行2.4 成品2.4.1 分批应符合“生物制品分批规程”规定2.4.2 分装应符合“生物制品分装和冻干规程”规定2.4.3 规格应为经批准的规格2.4.4 包装应符合“生物制品包装规程” 和附录I M的有关规定3 检定3.1 原液检定3.1.1 生物学活性依法测定（附录X G）3.1.2 蛋白质含量依法测定（附录VI B 第二法）3.1.3 比活性 为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg 蛋白质应不低于1.7×105IU 3.1.4 纯度3.1.4.1 电泳法依法测定（附录IV C）用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15.0％，加样量应不低于10μg（考马斯亮蓝R250染色法）或5μg（银染法）经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0％ 3.1.4.2 高效液相色谱法依法测定（附录III B）色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以A相（三氟乙酸-水溶液：取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀）、B相（三氟乙酸-乙腈溶液：取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀）为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱（0～70%B相）。

上样量不低于10mg，于波长280nm处检测，以牛碱性成纤维细胞生长因子色谱峰计算理论塔板数应不低于2000，按面积归一化法计算，牛碱性成纤维细胞生长因子主峰面积应不低于总面积的95.0%3.1.5 分子量依法测定（附录IV C）用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为15.0％，加样量应不低于1.0μg，制品两条蛋白带的分子质量应分别为17.5kD+1.875kD和22.0kD+2.20kD3.1.6 外源性DNA残留量每1支应不高于10ng（附录 IX B） 3.1.7 等电点主区带应为9.0～10.0,供试品的等电点与对照品的等电点图谱一致（附录IV D）3.1.8 紫外光谱扫描用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至约100μg/ml～500μg/ml，在光路1cm、波长230nm～360nm下进行扫描,最大吸收峰波长应为277±3nm（附录II A）3.1.9 肽图（每半年测定一次） 依法测定(附录VIII E),应与对照品图形一致 3.2 半成品检定3.2.1 生物学活性应按经批准的方法预处理供试品，依法测定（附录 X G ），应符合规定3.2.2无菌检查应按经批准的方法预处理供试品，依法检查（附录XII A），应符合规定。

3.3 成品检定除外观、装量检查外，应按经批准的方法预处理供试品后，进行其余各项检定3.3.1 鉴别试验按免疫印迹法（附录VIII A）或免疫斑点法（附录VIII B）测定，应为阳性3.3.2 物理检查3.3.2.1 外观 应为无色透明凝胶3.3.2.2 装量依法检查(附录V F)，应符合规定3.3.3 pH值按经批准的方法对样品进行预处理,应为6.5～7.5（附录V A）按1：5的比例用水对凝胶进行稀释）3.3.4 生物学活性按经批准的方法对样品进行预处理，应为标示量的70%～200%（附录X G）用RPMI1640培养基预稀释后测定） 3.3.5 无菌检查依法检查（附录XII A），应符合规定4 保存、运输及有效期于2～8℃避光处保存和运输自生产分装之日起，按批准的有效期执行5 使用说明应符合“生物制品包装规程”的规定和批准的内容。