新版肠道xx核酸检测试剂注册技术审查指导原则（202x年）汇编.docx

新版肠道xx核酸检测试剂注册技术审查指导原则（202x年）汇编 附件4 肠道**核酸检测试剂注册技术审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对肠道**核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考 本指导原则是针对肠道**核酸检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化 本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则 本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整 一、范围 （一）肠道**简介 肠道**属于小RNA**科肠道**属，能引起人类致病的肠道**有多种，包括人肠道**A、B、C、D组，有100多个血清型人类肠道**主要包括：脊髓灰质炎**、柯萨奇**A组（Coxsackievirus A，CA）、柯萨奇**B组（Coxsackievirus B，CB）、人肠道致细胞病变孤儿**（简称埃可**）（Echovirus ECHO）、新肠道**等。

新肠道**为1969年后陆续分离到的，例如新型肠道**71型（EV71）等近年来，鼻**（Rhinovirus）被划入肠道**属，鼻**包括A、B、C组，已经先后分离得到140多个血清型 肠道**为球形，直径28～30nm，核衣壳二十面体立体对称，无包膜衣壳由60个相同的壳粒组成，排列为12个五聚体，每个壳粒由VP1、VP2、VP3和VP4四种蛋白组成 肠道**基因组为单股正链RNA，全长约为7.2～8.4kb，基因组分为三部分，两端为保守的非编码区，在肠道**中同源性非常显著，其中5’端非编码区常作为肠道**通用检测试剂检测的靶基因中间为连续开放读码框，包含结构蛋白编码区和非结构蛋白编码区，结构蛋白编码区依次编码VP4、VP2、VP3和VP1共４个衣壳蛋白衣壳蛋白不仅含有抗原决定位点，而且还有决定**组织嗜性的受体识别位点，介导**与细胞的吸附和进入非结构蛋白编码区主要负责编码与**基因组复制以及**颗粒包装等有关的蛋白及酶，它们在RNA复制、细胞器修饰，细胞裂解及形态形成中发挥各自不同的功能 （二）肠道**致病性 肠道**在肠道中增殖，但通常不引起肠道疾病90%以上肠道**感染为隐性感染，或仅出现轻微的上呼吸道感染或流感样症状。

不同肠道**可以引起相同的临床症状，同一种**可引起几种不同的临床疾病 肠道**的传染源为患者和无症状的**携带者传播途径主要是粪-口途径，也可通过呼吸道传播，夏秋季是一年之中的主要流行期肠道**以上呼吸道、咽喉和肠道为侵入门户，先在局部黏膜和咽、扁桃体等淋巴组织和肠道集合淋巴结中初步增殖，然后释放入血，形成第一次**血症扩散至带有受体的靶组织，再次增殖后，引起第二次**血症和临床症状脊髓灰质炎**识别的受体为免疫球蛋白超家族的细胞黏附分子，只有很少的组织表达这种受体，如脊髓前角质细胞、被根神经节细胞、运动神经元、骨骼肌细胞和淋巴细胞等，柯萨奇**和埃可**识别的受体在组织和细胞中分布广泛，包括中枢神经系统、心、肺、胰、黏膜、皮肤和其他系统等，因而引起的疾病谱复杂，大多数肠道**为杀细胞**、直接对靶细胞产生裂解性感染各年龄段人群均可感染肠道** 肠道**所致的主要疾病有：1.手足口病：由肠道**感染而引起，以发热，咽喉痛，全身不适，手、足、口腔等部位皮疹或疱疹为主要特征的常见传染病，大多数手足口病患者症状轻微，并且具有自限性，但有相当一部分患者有致死性心肺功能疾病和神经系统并发症，个别重症患者病情进展迅速，甚至可导致死亡。

我国手足口病疫情尤为严峻，其已成为严重影响我国居民生命和健康的公共卫生问题 手足口病致病病原体传染源为患者或隐性感染者，主要的传播途径为粪-口传播，也可经接触患者的疱疹液传播，接触病人和携带者的粪便、唾液和疱疹液污染的日常生活用品均可传播此病原体，近年来的报道显示，该病原体也可垂直传播，导致新生儿重症感染人对肠道**普遍易感，不同年龄组均可感染发病，以5岁以下儿童为主，尤以3岁以下儿童发病率最高，该病流行无明显的地区性，全年均可发生，一般5—7月为发病高峰该病的潜伏期一般为2—10天，平均潜伏期为3—5天，感染者发病前的数天即可从其咽拭子样本和粪便样本中检出**，病程为7天左右，咽部排毒可持续在发病后1—2周，而粪便排毒可持续至发病后3—5周 引起手足口病的肠道**包括柯萨奇**A组的2、4、5、6、7、9、10、16型等，B组的1、2、3、4、5型等，肠道**71型及埃可**等，其中以EV71和CA16型较为常见 2.无菌性脑膜炎：肠道**感染引起的一种疾病，常表现为短暂发热、头痛等，偶尔有肌肉酸痛，或伴有皮疹，重者出现颈项强直、嗜睡、昏迷、意识障碍、脑膜刺激征等症状。

目前发现肠道**中有60多个血清型能引起无菌性脑膜炎，包括脊髓灰质炎**所有型别、柯萨奇**A组中的大多数型别、柯萨奇**B组的1—6型、埃可**大多数型别和肠道**71型等 3.脊髓灰质炎：是由脊髓灰质炎**感染而引起的疾病，其中85%由Ⅰ型脊髓灰质炎**引起，在我国曾有由Ⅱ、Ⅲ型**感染而发病的病例侵犯脊髓前角运动神经细胞，导致弛缓性肢体麻痹，多见于儿童，故亦称小儿麻痹症 4.疱疹性咽峡炎：主要由柯萨奇**A组某些血清型引起，典型的症状是在软腭、悬雍垂周围出现水泡性溃疡损伤 5.流行性胸痛：常由柯萨奇**B组引起，症状为突发性发热和单侧胸痛 6.心肌炎和心包炎：主要由柯萨奇**B组引起在婴儿室可引起暴发性流行，死亡率高散发流行于成人和儿童 7.眼病：由柯萨奇**A组24v型引起急性结膜炎和EV-D-70型引起的急性出血性结膜炎 此外，肠道**感染可能还与**感染后疲劳综合征、糖尿病相关 （三）本指导原则适用范围 1.本指导原则适用于利用荧光探针聚合酶链式反应（Real-time PCR）或其他类分子生物学方法，以特定的肠道**基因序列为检测目标，对来源于人体样本中的肠道**核酸进行体外定性检测，临床用于辅助诊断手足口病等肠道**感染相关性疾病。

涉及其他临床用途的肠道**核酸检测试剂可参考本指导原则手足口病致病病原体中未包含鼻**，因此，鼻**不在本指南的讨论范围内 2.临床用于检测手足口病致病病原体的检测试剂，适用样本类型应为鼻咽拭子、咽拭子、粪便/肛拭子、疱疹液、脑脊液（仅限出现神经系统症状的病例）、血液等 3.本指导原则适用于肠道**通用核酸检测试剂、单一**种检测试剂及单一**血清型检测试剂通用检测试剂所检**型别应至少包括柯萨奇**A组的2、4、5、6、7、9、10、12、16型等，B组的1、2、3、4、5型等，肠道**71型及埃可**等；针对柯萨奇**核酸检测试剂所检**型别应至少包括上述A组与B组中的血清型；针对柯萨奇A组或B组核酸检测试剂所检**型别应至少包括上述该组所列血清型针对埃可**核酸检测试剂所检**型别应至少涵盖埃可**3、6、11、14、16、19、25、30等血清型 二、注册申报资料要求 （一）综述资料 综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、有关产品主要研究结果的总结和评价以及其他等内容，其中，与预期用途相关的临床适应症应重点描述申报产品所检测的肠道**型别与临床适应症的相关性及相关肠道**在我国的流行特征；产品描述应明确申报产品所有可检出的肠道**型别、尚未验证的肠道**型别；同类产品在国内外批准上市的情况，应着重从所检**型别、不同型别检测的最低检测限及不同型别间的交叉反应等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。

综述资料的撰写应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告202x年第44号）的相关要求 （二）主要原材料研究资料 此类产品的主要原材料包括引物、探针、DNA聚合酶、dNTP、逆转录酶、尿嘧啶DNA糖基化酶（如适用）、核酸分离/纯化组分（如有）、试剂盒质控品及企业参考品等应提供主要原材料的选择与来源、制备及质量标准等的研究资料、质控品的确认试验资料；生产企业还应提供企业参考品的原材料选择、来源、质量指标、参考品的制备及阴阳性的确认过程等 1.引物和探针：包括申报产品检测靶序列的引物和探针以及内对照的引物和探针应详述引物和探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况针对检测靶序列的引物和探针，建议设计两套或多套引物、探针以供筛选，针对所有预期适用的肠道**型别进行检出准确性和特异性（如交叉反应）的评价，可采用扩增靶序列与所有型别肠道**基因组比对研究的方法，最终确认最佳组合，并提交筛选的研究数据引物、探针的质量标准应至少包括序列准确性、纯度检查、浓度检查及功能性实验等。

2.酶：需要的酶主要包括逆转录酶、DNA聚合酶，其质量标准如下：2.1逆转录酶应包括核酸逆转录活性、无核酸内切酶活性等 2.2 DNA聚合酶应包括DNA聚合酶活性、无核酸内切酶活性、热启动能力、热稳定性等 2.3如申报产品中包含尿嘧啶DNA糖基化酶，应对其酶活性及热稳定性等质量控制标准进行规定 3.dNTP：质量标准应至少包括纯度检查及功能性实验等 4.核酸分离/纯化组分（如有）的原理介绍、主要组成、主要原材料的质量控制标准及相关验证资料 5.试剂盒质控品 试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒质控品来实现，针对阳性质控品和阴性质控品申请人应明确质控品的来源、质量标准、质控品阴阳性的确认方法及相关验证资料申报产品的质控体系应考虑以下几个方面：5.1阳性质控品中应含有天然的或人工合成的包含试剂盒所检测靶序列的RNA，至少应包含临床较常见的血清型质控品应参与样本处理和检测的全过程，如核酸的平行提取等步骤企业应对质控品的检测结果（如Ct值）做出明确的范围要求 5.2阴性质控品应不含试剂盒所检测靶序列的RNA，质控品应参与样本处理和检测的全过程，如核酸的平行提取等步骤，以对可能存在的交叉污染产生的假阳性结果进行质量控制。

5.3内对照（内标）可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，申请人应对内对照（内标）的引物、探针设计和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制对内对照的检测结果（如Ct值）亦应做出明确的范围要求 6.企业参考品：应详细说明有关企业参考品的原料选择、制备、阴阳性确认等试验 企业参考品的核酸性质应与产品预期检测的靶物质一致鉴于肠道**为RNA**，企业参考品可采用灭活**、含有肠道**基因组的装甲**（或假**）、人工克隆或合成的肠道**基因组RNA具体要求如下：6.1阳性参考品和阴性参考品 阳性参考品应包含本指南范围中规定申报产品至少应检出的肠道**血清型，例如，肠道**通用型检测试剂阳性参考品应至少包含柯萨奇**A组的2、4、5、6、7、9、10、12、16型等，B组的1、2、3、4、5型等，肠道**71型及埃可**等，其他单一**种及单。