RAW264.7小鼠巨噬细胞protocol.doc

RAW264.7细胞株的相关信息ATCC: 美国模式培养物集存库(American type culture collection)的简写收到冷冻管细胞的处理方式1. 收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 假设有请立即通知细胞株请尽速开场培养，或立即冷冻保存(置于–70℃，隔夜后，移到液氮)2.收到T25 flask细胞的处理方式于寄送过程中，为防止起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基2.1.  检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，假设有任何问题，不要翻开盖子，请立即通知细胞实验室2.2.  将原封之T25 flask 静置于37℃， 5% CO2 培养箱中，使细胞回温至37℃，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长2.3.  隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask ，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘， 则将细胞做传代培养RAW264.7细胞株的Cell Culture一、RAW264.7细胞培养的特点1、RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形，功能活泼时，可呈多突形。

细胞核为圆形或椭圆形，染色较深贴壁特别结实2、RAW264.7具有很强的吞噬能力，当吞噬抗原后，细胞会释放趋化因子，进一步促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形，镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代3、每次传代都很难消化下来用力过大则对细胞损伤较大，这种细胞传代时接种密度要大，否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化，细胞变成长形，并且不能回复，这是培养这种细胞时最需要注意的问题4、对于RAW264.7细胞他的声场时喜欢结伴正常生长状态应该是一小片一小片的生长，片片之间不连接，等到长到更多更密的时候会连成大片，并且会叠加成层所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代5、RAW264.7细胞传代后贴壁时间较短，半小时就能贴很多，刚贴壁是细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面生长一段时间后，局部细胞会变成类似四角形，伸出伪足之类的这个时候就是提醒你注意传代了，这局部细胞如再不传代，很容易就老化掉二、RAW264.7细胞传代1) 将培养瓶内旧的培养液弃掉， 然后用D-Hanks液洗两次，(一定要洗干净，以免影响胰酶的消化作用)2) 参加0.25%胰酶-EDTA消化，25cm培养瓶加0.4ml， 37度消化5min，镜下看到细胞变圆，间隙增大。

〔值得注意的是该细胞对机械损伤比拟敏感〕3)立即加含10%FCS的培养液终止消化，用细胞刮刀轻刮，注意，这时候用吸管吹不下来，但是刮刀却很容易刮下来，而且对细胞的损伤极小4)离心，弃上清，加新的培养液(10%FCS)，小心吹匀，分装入新的培养瓶三、RAW264.7细胞冻存及复苏〔一〕细胞冻存1. 配制冻存培养液；〔通用的为培养基：血清：DMSO=7：2：1，但其中的血清可进展调整，如上面的仁兄用的4：5：1，比例过高〕2. 取对数生长期的细胞〔冻存前一天换液〕，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，参加适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml〔不超过冻存管容量的80%〕；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。

也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内〔具体操作为4°C 20min，-20°C30min，-70℃过夜，转入液氮中〕〔二〕 细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化〔1min以内溶解完毕，不能将口进入水面下〕2. 从37℃水浴中取出冻存管，翻开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3. 离心， 1000rpm，5min；4. 弃去上清液，参加含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；(复苏时细胞密度稍大，可提高复苏效率)5. 次日更换一次培养液，继续培养〔可更换一半培养液，防止跨度太大，影响细胞状态〕〔三〕接种四、RAW264.7细胞形态不好时的处理方法1.倒掉旧的培养基，参加3ml新的培养基〔有无血清的都可〕洗涤一次，用滴管吸走，然后再参加3ml的培养基，进展预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走这时侯再开场正式的消化、吹打2.把吹打下来的细胞悬液参加到新的培养瓶内，培养瓶事先参加培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。

10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次选择一个时间点，已经有局部细胞贴壁的情况下，重新置于干净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，参加3ml新培养基再轻轻洗一次然后参加完全培养基培养后续观察细胞生长情况以及形态我称之为“二传〞3.如果一次效果还不理想，可重复屡次直到找到细胞完美形态其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况喜欢多一点数量长得好的细胞就等贴壁细胞比拟多点的时候再传反之亦然不明之处：培养之前，一切与细胞接触的玻璃器皿和器具都要进展过去热源处理〔200-250℃烘烤4-6h〕..RAW264.7细胞株Cell Culture的材料〔一〕仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱〔4℃、-20℃、-70℃〕5.倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱〔二〕玻璃器皿1. 吸管〔弯头、直头〕2. 培养瓶3. 玻璃瓶〔250ml、100ml〕4. 废液缸〔三〕塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 胶塞4. 移液管〔10ml〕5. 15ml离心管6. 冻存管〔1～2ml〕〔四〕其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5. 移液枪〔五〕试剂1. D-Hanks液2. 胎牛血清3. 培养液4. 双抗〔青霉素、链霉素〕5. 胰蛋白酶〔0.25%〕6.7.4%NaHCO37. DMSO〔分析纯〕或无色新鲜甘油附1.胎牛血清品牌整理第一类，最高级别，是专门用于干细胞的特级胎牛血清1、Hyclone的特级胎牛血清目前，性能最好的血清，还是要说说Hyclone的特级胎牛血清，货号是SH30070.03，它是Hyclone的“招牌菜〞。

Hyclone特级胎牛血清〔Defined FBS〕，货号SH30070，是世界上唯一经过40纳米过滤的顶级胎牛血清，极佳的促细胞生长作用及产品稳定性内毒素含量≤10EU/ml，血红蛋白含量≤10mg/dl此血清可以广泛用于各种细胞培养，包含任何干细胞系的培养2、Gibco的特级胎牛血清稍次一点的是Gibco公司在美国原装生产的特级胎牛血清，这款血清，货号是16000-044，是100nm过滤3次，内毒素和血红蛋白含量都可以与Hyclone的SH30070.03相媲美也可以用于培养大局部的干细胞系同样是美国来源，所以渠道特殊3.TCB的特级胎牛血清TCB〔Tissue Culture Biologicals〕公司作为一家生物行业类的著名供给商，成立于1978年，大局部血清的采集和加工都在加利福尼亚每一批的原材料都经过严格筛选，所有的产品都在FDA认证的cGMP车间进展！4. Bioind特优级胎牛血清血源来自北美和澳大利亚BioInd公司的生产完全符合GMP的要求，并通过ISO9000:2001和ISO 13485:2003质量认证以平安，稳定，高效为原则的BioInd公司，所有的产品质量均完全符合国际标准。

Biological Industries主营细胞培养类产品，BioInd工厂加工的胎牛血清均符合USDA标准及欧洲标准血清根据美国农业部标准，原始血清均采自未发生疯牛病〔BSE〕和口蹄疫〔FMD〕疫情的国家Biological Industries三步滤菌处理法，最后的过滤步骤为连续通过三个100纳米的滤膜血清生产的干净级别为100级所有分装工作台都通过高效微粒空气过滤器过滤，并保持正压分装环境要对总微粒、悬浮微粒数和压力进展监控分装之后，终产品迅速-20度冻存，并隔离，直到所有的质量控制检测完成第二类，优等胎牛血清1.Hyclone的加拿大优等胎牛血清性价比最高的是Hyclone加拿大优等胎牛血清〔CharacterizendFBS〕SH30396.03 血清采自加拿大，由hyclone公司总部的员工采集加工，采集方法，加工过程，检定标准与美国原产优等胎牛血清完全一致，市场价格低于美国原产的经过3次100nm过滤，内毒素含量≤25EU/ml，血红蛋白含量≤25mg/dl2、Hyclone的南美优级胎牛血清大体与加拿大的优等血清是一样的，级别也非常相似，货号是sv30087.02，该胎牛血清来源于南美洲，以封闭的心脏穿刺方式采集，产品经3次100nm 过滤，经严格检测确保无支原体，细菌病毒检测依据美国药典〔USP〕和美国联邦法规第九篇〔9CFR〕，内毒素含量≤10 EU/ml，血红蛋白含量≤20 mg/dl，完全符合美国 HyClone® 优等胎牛血清的检测标准。

3、Gibco的澳大利亚胎牛血清情况和Hyclone的澳大利亚胎牛血清差不多，市场价也是3200元/500ml左右这一级别的血清，也能用于干细胞培养，可是，不象特级胎牛血清则优秀因为，此胎牛血清属于澳大利亚生产的，不在疫区，可以正常报关进口，目前没有受到任何影响，所以，就目前而言，算是最好的胎牛血清了，有不少客户都此血清来培养干细胞，效果还是比拟不错4、TCB的优级胎牛血清情况和Hyclone的澳大利亚胎牛血清差不多，市场价也是2300元/500ml左右这一级别的血清，也能用于干细胞培养，可是，不象特级胎牛血清则优秀第三类，一般级别的进口胎牛血清1、Hyclone的南美胎牛血清目前，市场上用的最多的Hyclone血清是南美胎牛血清(FBS)SV30087 ，此血清采自南美，在国内〔〕过滤并测试检验，经三次100纳米过滤，根据中国商标法的规定标贴中文标签，内毒素含量≤10EU/ml,血红蛋白含量≤20mg/d此血清广泛用于各种肿瘤细胞的培养，还没有资料记载能够用于干细胞，也听说有少数人用于干细胞培养的，不过，因为本身血红素比拟高，所以，最好不要用于干细胞，2、Gibco的南美胎牛血清这款血清，是Gibco针对Hyclone南美胎牛血清做的，价格比拟贵，好似是1780元/500m。

3、Gemini的胎牛血清4、TCB的胎牛血清5、PAA的胎牛血清6、JRH澳洲胎牛血清第四类，国产的各种系列胎牛血清国产的胎牛血清，国内没有严格意义的胎牛血清，胎牛血清本身是需要穿刺取血的，而国内都是剖腹产出胎牛，8小时左右取血，然后，进展过滤分装所以，国产的胎牛血清不是严格意义的胎牛血清价格廉价但是遇到的问题非常多附2.Hyclone液体培养基普通液体培养基列表描述。