彩图骨髓干细胞体外组织工程软骨形成的实验研究.doc

1彩图骨髓干细胞体外组织工程软骨形成的实验研究作者：宋世锋，肖海涛，武伟，袁素，谢瑶云，吴多能，白殿卿【摘要 】 [目的] 探讨骨髓干细胞(BMSCs)在体外不同载体中软骨形成的能力和可行性[方法] 分离培养猪 BMSCs，将第 3 代BMSCs 以载体内多点注射和表面点滴法植于 A 组：Ⅱ型纤维胶原蛋白海绵(fibrin collagen sponge)，B 组：生物蛋白海绵(fibrin collagen sponge and bFGF);C 组：明胶海绵 (gelatin sponge)3种载体上，于 4 周取材进行组织学分析 [结果] 纤维胶原蛋白海绵和生物蛋白海绵组均有软骨细胞形成，明胶海绵无细胞生长利用SPSS 10.0 软件统计学处理，显示 B 组软骨细胞阳性数量(92.75±10.57)多于 A 组(36.45±8.34) ，有统计学差异(P<0.01)，两组都明显多于 C 组 (0)，有统计学差异(P<0.01)[结论]MSCs经分离扩增后种植于三维立体结构的纤维蛋白海绵载体上，在含有TGF β1 培养液中形成软骨;在 TGF β1 和 FGF 的双重因子培养中，其软骨的形成能力明显增加。

【关键词】 骨髓基质细胞; 载体; 软骨形成; 组织工程Abstract：[Objective]To investigate the chondrogenic ability and feasibility of bone mesenchymal stem cells (BMSCs) 2in three kinds of cellular carrier.[Method]BMSCs were separated and cultured into the third generation,which were cultivated in three knids of carriers by multi point injection into and dropping on the surface of carriers(fibrin collagen sponge, group A; fibrin collagen sponge and FGF,group B and gelatin sponge, group C ).All samples were analyzed after four weeks.[Result]There were a few chondrogenic cells in group A,much more chondrogenic cells in group B,and no cells in group C. According to analysis with SPSS 10.0 software,There were more cartilage cells (92.75±10.57) in group B than in group A(36.45±8.34).It was statistical different (P<0.01).[Conclusion]BMSc can be formed to chondrogenesis after augmented and cultivated in the three dimensional fibrin collagen sponge with the medium of contained transforming growth factor β1.Its ability of chondrogenesis is increased evidently in cultured by diplex growth factors(TGF and FGF).Key words：bone mesenchymal stem cells; cellular carrier; chondrogenesis; tissue engineering骨髓干系胞(bone marrow stromal cells，BMSCs) 也称骨3髓的间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)，BMSCs 的提取分离及传代培养技术已逐渐成熟。

如何将 BMSCs 种植于载体上进行体外人工培养形成软骨样组织还是在探讨中的问题本研究旨在探讨 BMSCs 能否在体外几种载体中提供软骨诱导微环境，促进 BMSCs 向软骨分化并形成组织工程软骨1 材料与方法1.1 细胞培养BMSCs 培养：抽取 8 周龄幼猪髂骨骨髓 5 ml，用密度梯度离心法分离出有核细胞，再以 PBS 缓冲液(Gibco 公司，美国)和无血清 DMEM(Gibco 公司，美国) 各离心洗涤 1 次制备含有 0.05 u/ml 青霉素、 0.05 μg/ml 链霉素(Gibco 公司，美国)、TGF β1(Sigma 公司，美国)的浓度为 5 ng/ml、10%胎牛血清(Hyclone 公司，美国) 的 DMEM 培养液计数有核细胞，以6×105 个/cm2 的密度接种于培养皿(Gibco 公司，美国)，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养，贴壁法分离 BMSCs 接种 3 d 后首次换液待细胞生长达到 80%～90%融合后，用 0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 消化，以 1.5×104 个/cm2 的密度接种，常规传代扩增，第 3 代细胞用于实验41.2 载体制作、细胞种植及分析方法将无菌胶原蛋白海绵(fibrin collagen sponge，Sigma 公司，美国)、生物蛋白海绵(fibrin collagen sponge +b-FGF，辽宁绿谷制药)、明胶海绵 (gelatin sponge 南京金陵制药)在无菌条件下裁剪成 5 mm×5 mm×5 mm 方块状。

A 组：胶原蛋白海绵 ;B 组：生物蛋白海绵;C 组：明胶海绵三组分别取 16 个标本，将第 3 代细胞按 5×107 个/cm2 的密度分别以载体内多点注射和表面点滴法接种到材料上，每块材料接种细胞悬液 300 μl在 37℃ 、5%CO2、100% 饱和湿度下加含 TGF β1(5 ng/ml，)的 DMEM 培养液，每隔 2 d 换液 1 次，观察细胞增殖、细胞在支架材料上的黏附及细胞外基质的分泌情况培养 4 周取材进行组织学分析利用细胞直接技术法测定不同载体细胞生长情况，即取免疫组化染色的组织切片，选取三种不同载体构建的组织染色切片 4 张，每张切片随机选取 20 个高倍视野进行直接阳性细胞计数，然后组间比较[mean±S.D.(n=4)]应用 SPSS 10.0 软件进行统计学分2 结 果2.1 细胞生长情况原代细胞呈集落样生长，培养 5～7 d 后可见均匀的集落形5成纺缍形或长梭形，类似成纤维细胞，但体积较小，核仁 1～2 个，类似于既往文献报道的 BMSCs 形态传代后细胞体积有所增大，有角状突起，增殖迅速，细胞接近融合后呈“旋涡”样生长接种到材料上后，细胞与胶原蛋白纤维紧密黏附，分泌细胞外基质包埋纤维，基质逐渐增多填满纤维间的空隙(图 1、2) 。

2.2 大体观察B 组标本体外培养 2 周后体积收缩，直径约为 3 mm，至 4周直径为 2 mm;而其他各组均维持直径在 3～4 mm 的范围内培养 4 周后，A、B 组表面均光滑，细腻有光泽，形状近似圆球形;C组表面粗糟，呈碎片状;B 组标本呈灰白色，同时有很好的硬度和弹性，而 A 组标本呈灰黄颜色，色较暗，弹性和硬度不及 B 组2.3 组织学、电镜观察2.3.1 光镜检查 标本制备 标本经 10%的福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE 染色，光镜观察，并采用免疫组化 SP 法进行标记，所用Ⅱ型胶原试剂盒来自北京中杉金桥生物技术有限公司光镜结果：A 组标本显示：淡紫蓝色软骨基质中见有稀疏的软骨细胞组;可见软骨陷窝样结构，陷窝周围可见蓝染的细胞外基质6成分;B 组：淡紫蓝色软骨基质中见有软骨细胞，多为单个散在，局灶几个细胞簇聚，细胞数量明显多于 A 组，而且组织紧密，基质蓝染程度偏高A 组的组织学与 B 组类似，其陷窝和细胞间的基质沉积较 B 组少C 组：见散片状较细的胶原基质，未见细胞生长利用 SPSS 10.0 软件统计学处理，显示 B 组软骨细胞阳性数量(92.75±10.57)多于 A 组(36.45±8.34) ，有统计学差异(P<0.01)。

两组都明显多于 C 组 (0)，有统计学差异(P<0.01)(图 3～6) 2.3.2 电镜检查 透射电镜样品制备：取培养组织 1 mm×1 mm×1 mm 大小，经 2.5%戊二醛前固定，1% 锇酸后固定，丙酮系列脱水，环氧树脂 Epon 812 包埋，Leiac 超薄切片机半薄切片定位后，再行超薄切片，醋酸铀及柠檬酸铅双重染色，JEM-1010 型透射电镜观察，摄片图 1、2 第 1 代细胞呈集落形成纺缍形或长梭形，类似成纤维细胞;2 代后细胞体积有所增大，有角状突起，增殖迅速，细胞接近融合后呈“旋涡”样生长 图 3、4 (A 组) 低倍镜显示淡紫蓝色软骨基质中见稀疏散在的软骨细胞，高倍镜见圆形透亮的软骨细胞 (HE×100) (HE×400) 图 5、6 (B 组) 显示淡紫蓝色软骨基质中见成簇的的软骨细胞，软骨基质丰富(HE×100);高倍镜显示细胞呈圆形或椭圆形，核深染(HEX400) 电镜结果：B 组：软骨基质中见大量的胶原纤维，排列不规则软骨陷窝内软骨细胞单个、4 个、4 个7或多个存在，呈不规则形，表面有许多微小突起细胞周边部可见基质颗粒细胞质较丰富，胞质内可见粗面内质网、高尔基复合体明显扩张，线粒体多见，少量脂滴。

细胞核呈圆形或椭圆形(图 7) A 组：软骨基质同一组，无明显改变，软骨细胞多呈单个存在，少数为两个，细胞极不规则，突起增大，突起表面有较大空白裂隙，细胞器没有 B 组发达，粗面内质网、高尔基复合体没有明显扩张，细胞核异染色质增多(图 8)2.3.3 免疫组化 标本经 10%的福尔马林固定，石蜡包埋切片,HE 染色，光镜观察，并采用免疫组化 SP 法进行标记，所用 Ⅱ型胶原试剂盒来自北京中杉金桥生物技术有限公司A 组：(图 9) 淡紫蓝色软骨基质中见有软骨细胞，多为单个散在，局灶几个细胞簇聚 (HE×400)，软骨细胞较模糊，可见单个肥大，胞膜不清，软骨基质Ⅱ型胶原 (+);B 组：(图 10) 淡紫蓝色软骨基质中见稀疏的软骨细胞 (HE×400)，软骨细胞清晰，软骨基质 Ⅱ型胶原 (++)图 7 (A 组-5000 倍) 软骨基质中见较多的胶原纤维，软骨细胞多呈单个存在，少数为两个，细胞极不规则，突起增大，突起表面有较大空白裂隙，细胞器没有 B 组发达，粗面内质网、高尔基复合体没有明显扩张，细胞核异染色质增多 图 8 (B 组-5000 倍) 软骨基质中见大量较细的胶原纤维，有 64 nm 周期横纹，直径在17～50 nm 之间，排列不规则。

软骨陷窝内软骨细胞 1～2 个，呈8不规则形，表面有许多微小突起细胞周边部可见基质颗粒细胞质较丰富，胞质内粗面内质网、高尔基复合体明显扩张，线粒体多见细胞核呈圆形或椭圆形(图 1～2)图 9 (A 组) 淡紫蓝色软骨基质中见稀疏的软骨细胞 (HE×400)，软骨细胞较模糊，软骨基质Ⅱ型胶原 (+) 图 10 (B 组) 淡紫蓝色软骨基质中见有多个软骨细胞，多为单个散在，局灶几个细胞簇聚 (HE×400)，软骨细胞较清晰，可见单个肥大，胞膜不清，软骨基质Ⅱ型胶原 (++)3 讨 论3.1 骨髓的间充质干细胞分离培养与分化骨髓的间充质干细胞(mesenchymal stem cells)又称骨髓基质细胞(marrow stromal cells，M。