多肿瘤抑制基因p16与肿瘤发生发展的关系【临床医学论文】.doc

临床医学论文-多肿瘤抑制基因 p16 与肿瘤发生发展的关系【关键词】 多肿瘤癌症是人类面临的最大难题，随着分子生物学和基因工程的进展，使我们认识到肿瘤发生的关键是正常细胞内基因组发生了改变，基因改变是导致肿瘤的根本原因［1］近期的研究结果显示从肿瘤的诱发到进展是一个多阶段、多因素的复杂过程，这个复杂过程包括肿瘤基因的激活和肿瘤抑制基因的失活，肿瘤基因和肿瘤抑制基因分别以正性和负性调节细胞的生长，并参与肿瘤的形成［2］到目前为止，人类已发现 100 多个癌基因和 10 多种抑癌基因80 年代中期抑癌基因被发现以来，其重要作用得到广泛认可，抑癌基因(tumor supress gene)是正常细胞在调控细胞增殖、分化等方面起重要作用的基因，它在保持基因组结构稳定、促进细胞生长、诱导细胞凋亡等方面均有重要意义，它的缺失或失活可引起细胞内癌基因(oncogene)的活化，造成细胞的过度增生、分化，导致恶性肿瘤的发生和发展癌基因和抑癌基因共同参与调节细胞周期活动的分子过程已为现今癌症研究的重要课题之一研究肿瘤发病的分子生物学机制，了解各种肿瘤细胞增殖周期中调控因子的状况，对于进行基因诊断、基因治疗无疑具有重大意义。

1 p16(MTS1)基因的发现和基本结构1992 年美国 Skolnick 等在黑色素瘤患者中发现有与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)相结合的蛋白，但这种蛋白的基因未被克隆出，随后对 100 个黑色素瘤细胞系采用染色体步移法和序列标记位点图进行分析，发现 1/2 的肿瘤细胞在染色体 9p21 区发生频繁的基因突变，推测该区域含有黑色素瘤的易感基因［2］，此后在许多人类肿瘤集及体外细胞系中均发现 9p21 区的缺失和突变1993 年，美国长岛冷泉实验室研究的细胞先驱 Serano 等利用酵母双杂和蛋白相关性筛选法(yeast two-hybrid protein interaction screen)发现并分离了特异性的细胞周期素依赖性激酶 4(CDK4)抑制蛋白(CDK4I)-p16 蛋白，证明 p16与 CDK4 结合后 cyclinD/CDK4 复合物的催化作用明显降低，并克隆了 p16 的cDNA1994 年美国盐湖城 Kamb 等［3］和圣地亚哥的 Nobori［4］分别报道发现一个新的抑癌基因：p16，两个研究小组发表了一项重要的研究成果发现一个新的抑癌基因：p16 蛋白，证明 p16 与 CDK4 结合后 cyclinD/CDK4 复合物的催化作用明显降低，并克隆了 P16 的 cDNA。

Kamb［3］在对黑色素瘤染色体 9p21易感区应用物理图(physical map)和序列标记位点图(sequence tagged stites,STSs)分析了 100 个黑色素瘤细胞系的纯合缺失，发现在两个区域与Serrano 报道的 p16 序列相近，命名为多发性肿瘤抑制因子 1(multiple tumor suppress 1,MTS1)和 MTS2，其中 MTS1 和 p16 完全吻合，而 MTS2 与 p16 序列有93%相同，现命名为 p15(kamb A.Science,94,264,436-440)p16 基因位于人类的 9 号染色体短臂(9p21)上，由3 个外显子和 2 个内含子组成，外显子 1 包括 E1α 和E1β，E1α，126bp；E1β，180bp；外显子 2 307bp；外显子 3 11bp全长8.5kb，氨基酸序列分析表明成熟的 p16 分子量为 15.84kD 的单链多肽，含有一个由 148 个氨基酸组成的开放阅读框架，具有一个有 4 个 ankyrin 序列组成(回钩状重叠的空间构型的蛋白结构)，这一构型为维持其活性所必需，参与蛋白与蛋白之间的作用［4］。

2 作用机制细胞增殖分裂是细胞最基本的生理活动，越来越多的研究证明，细胞分裂周期的精确性及定时性是正常细胞生长和分化所必需的，细胞作为机体的最小单位，其生长过程总是处于一种增殖的动态平衡之中，这才能保证机体正常的生长、发育这就意味着细胞内必然存在着促进和抑制增殖两种体系［5］，包含于这一过程中的蛋白质及基因的改变与肿瘤发生及其恶性表形密切相关典型的一个细胞周期包括有严格顺序的 4 个期即 G1SG2M，它是由 MPF(maturation promoting factor,MPF)所推动并受到信号转导途径和反馈环路的精密调控MPF 含两种蛋白质组分，其一为 cdc2 蛋白(cell division cycle 2 protein)，另一为细胞周期蛋白(cyclin)，在整个细胞周期中 cdc2 蛋白的浓度是稳定的，它的活动受到细胞周期蛋白的调节，细胞是否进入分裂周期以及分裂周期是否成功完成取决于其能否顺利通过若干关卡(check points)，其中最重要的是G1/S 转换和 G2/M 转换前者又称为“启动点(start)”或“限制点(restriction point)”，位于 G1 期末，DNA 合成的起始，后者位于 M 期的初始。

现已证明，激活的 CDK 在这两个转换过程中起关键作用［6］在高等的真核细胞，细胞周期蛋白分为 A、B、C、D、E 五种，它们分别在细胞周期的不同时期积累，激活相关细胞周期蛋白激酶(CDK)，使之具有蛋白激酶活性G1 期细胞周期蛋白是指在 G1 或 G1/S 交界处发挥作用启动细胞周期并促进 DNA 合成的周期蛋白，有 C、D、E 等多种，其中 cyclinD1 能激活 CDK4、6 调节 G1/S 转换，促进细胞分裂周期由 G1 期进入到 S 期，进行 DNA 合成［7］，cyclinD 实际上可以视为一种癌基因，其过度表达会导致细胞增殖失控最重要的研究发现是 CDK 抑制因子与肿瘤生长密切相关，对于 CDK 抑制因子 p21 的研究首先证明了这一点，p21 是作为含有 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)在内的 CyclinD-CDK 四聚体复合物中的一员在正常人纤维母细胞中首先被发现的［7］对 p16 的研究进一步阐明了 CDK 抑制因子在肿瘤发生发展中的作用这就构成了 cyclins(细胞周期素)-CDKs(细胞周期素依赖性蛋白激酶，cyclins dependent kinases)-CKIs(细胞周期素依赖性蛋白激酶的抑制蛋白，cyclins dependent kinases inhibitors)这一以 CDKs 为中心的细胞周期网络调控系统。

p16 通过与 cyclinD 竞争结合 CDK4、CDK6 抑制 cyclinD/CDK4 的活性，参与并调节细胞从 G0 期进入 G1 期，去除 p16 的抑制作用，将使细胞异常增殖，过度周期蛋白激活和/或抑制蛋白的失活，都会导致 CDKs 的过度作用，导致细胞非正常增生野生型抑癌基因 Rb 的蛋白产物 PRb 的活性是通过磷酸化作用获得的，CDK4、CDK6 作为 PRb 的激酶与此密切相关，Liu 等［8］提出 PRb 发生磷酸化后，导致与 PRb 结合的 TF(Transcription Factor)的释放，如 E2F，E2F 是通过激活与细胞增殖有关的基因，如 DNA 合成酶-α，从而调控细胞周期由 G1 期到 S期，E2F 与未磷酸化的 PRb 结合时没有转录活性，但与磷酸化的 PRb 分离后将激活 p16 基因转录，随着 p16 mRNA 水平的增多，和 CDK4、CDK6 结合的 p16 也增多，致使 cyclinD/CDK4、CDK6 的激酶活性受到抑制，低磷酸化的 PRb 为其活性状态，PRb 磷酸化水平下降，p16 基因的录也随之降低［8］Joseph Geradts 等［9］在实验中证实，在人类许多肿中，Rb 过表达的细胞系都伴有p16 表达下降，反之亦然。

在 p16 过表达的细胞系无一例外地有 Rb 蛋白和/或p53 蛋白失活，而 Rb 蛋白的失活对 p16 更有直接作用，Rb 蛋白可抑制 p16 蛋白表达，进一步影响 cyclinD 表达［10］Beach 等［11］认为正常细胞中存在着一个由 Rb、p16、cyclinD/CDK4、CDK6 共同组成的反馈调节圈p16 在正常细胞调控周期中起负反馈作用，p16 基因影响 Rb 基因在细胞增殖中的调节作用，结合细胞周期的研究，在 G1/S 转化过程中，PRb 由于磷酸化失活，失活的 PRb一方面促进细胞进入 S 期，另外 PRb 通过转录因子，如 E2F 促进 p16 的转录，反而又抑制 cyclinD-CDK 中间的反馈作用，而达到对细胞从 G1 期到 S 期的转变过程的调控除此之外，p53 对 p16 的表达也起负向调节作用目前发现的细胞周期抑制蛋白根据其结构和功能分为两类：一类包括 p15、p16、p18、p19；另一类包括 p21、p27它们对细胞增殖起负调控作用［8］p16 外显子 1 包括E1α 和 E1β 两种，p16β 是 p16 的另一个选择替换转录模本，它由位于 p16-exon1 上游约 15kb 最新发现的短片段(exon1β)拼接至 p16 外显子 2、3 上而成，那么就有可能产生两种转录产物：p16α mRNA 和 p16β mRNA［12］。

Duro 等［13］研究发现在 B 淋巴细胞位于 9p21 染色体 p16 外显子 1 上游的一个片段(0.18kb)的嵌合转录模本，它可作为 p16 选择拼接转录模本的一部分而被转录，它与编码 p16 蛋白的开放阅读框架(ORF)不一致，这种情况可能产生两种蛋白，p16 蛋白及另一截断的 p16 蛋白(p16β 蛋白)，分子量为 1.38kD，p16β 转录模本将能起始翻译产生一种不同于 p16 的蛋白，尽管 p16β 角色有待阐明，日前的研究证实大鼠的 p16β 在肿瘤抑制作用中扮演重要角色实验发现体外转染p16β cDNA 可抑制人或小鼠肿瘤的生长［13］p16β 转录模本在鼻咽部过度增生的上皮细胞及发生突变和过甲基化的鼻咽癌组织细胞中表达Quelle［14］等转染 p16β cDNA 到 3T3 成纤维细胞中而观察到细胞周期停滞在G0～G1 或 G2～M 期Liggett［14］同样通过细胞转染证实 p16β 和 p16 一样具有生长抑制作用，并这种抑制作用不需要功能性的 PRb 的存在鼠的p16β(p19ARF)比推断的人类 p16β 蛋白长 19 个氨基酸，但目前还没有人类细胞内源性 p16β mRNA 翻译产生蛋白的证据。

3 p16 基因及其产物在肿瘤中的失活机制p16 基因及其产物在人类许多原发性肿瘤和细胞株中发生改变，如脑肿瘤、头颈癌、肺癌、食管癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等［15］均发现较高的 p16 基因的失活，主要失活机制有：突变、纯合性缺失及 5′CPG 岛甲基化失活等1)p16 基因的突变包括无义突变、错义突变和移码突变其突变部位主要在外显子 1 和外显子 2虽然大部分肿瘤细胞系中检测到 p16 基因突变，但原发性肿瘤组织中除胰腺癌和食管癌及成胶质细胞瘤外，其它肿瘤 p16 基因突变率很低，SUN 等［16］利用 SSCP 直接测序的方法在42 例鼻咽癌和 2 个鼻咽癌细胞系均未发现 p16 基因的点突变，LO［17］等也发现在原发性鼻咽癌及鼻咽癌的异种移植物中均未发现 p16 基因突变Zhang 等只检测到 4/68 的原发性头颈鳞癌和 1/9 的头颈鳞癌细胞系中 p16 基因的点突变，所以点突变并不是 p16 基因失活的主要方式，且突变只有发生在编码 p16 蛋白4 个钩状重复结构区域内的 DNA 序列，才导致 p16 蛋白失去对 cyclinD/CDK 的抑制作用，而蛋白羧基末端区对结合与抑制 CDK活性并不重要。

2)Melo 等［18］通过对一些细胞系和原。