方法比较试验.ppt

方法比较试验一. 实验目的n n1.掌握本实验的实验原理；n n2.掌握两种不同操作方法的操作过程；n n3.了解血清葡萄糖测定的临床意义；n n4.学会应用分光光度计对各组数据进行统计处理二.实验原理n n方法比较试验是将候选方法与准确度已知的方法（如参考方法或经典方法）作对比分析,同时测定一批标本计算出两种方法间测定结果的差值，以评价候选方法的准确度，是考核候选方法是否可被采用的重要试验用于检测候选方法的恒定误差和比例误差，如对适当的数据进行分析也可以提供误差的性质，本实验以邻甲苯胺法作为比较方法，评价GOD-POD法测定血糖的总系统误差邻甲苯胺法测定血糖原理： 在热的醋酸溶液中，葡萄糖醛基与邻甲苯胺(O-T)缩合成糖基胺，经脱水，生成希夫碱（Schiff base），经分子重排生成蓝绿色化合物，在630nm波长处有一吸收峰，吸光度大小在一定范围内与血糖浓度成正比 n n邻甲苯胺邻甲苯胺+葡萄糖葡萄糖 葡萄糖基胺葡萄糖基胺 希希夫碱夫碱 蓝绿色化合物蓝绿色化合物缩合脱水三.试验试剂器材n n1.邻甲苯胺试剂邻甲苯胺试剂n n2.GOD-PODGOD-POD法试剂盒法试剂盒n n3.待测血清待测血清 四种含血糖浓度不同的血清：四种含血糖浓度不同的血清：2.2mmol/L2.2mmol/L、、6.7mmol/L6.7mmol/L、、5.2mmol/L5.2mmol/L、、3.7mmol/L.3.7mmol/L.n n4. 葡萄糖标准液（葡萄糖标准液（5.55mmol/L5.55mmol/L））n n5.其它：移液器、可见分光光度计、水浴箱等其它：移液器、可见分光光度计、水浴箱等四、操作步骤1．每人随机选择血糖含量高低不同的病人血清标本2份。

2．将每份标本分别用两种方法各测定2次将标本按某次序排列先测一次，第2次测定时，标本顺序全部倒过来例如，第1次序号为1、2、3、4、5、6、7、8，第2份序号为8、7、6、5、4、3、2、13．计算出两法各自的测定结果具体操作如下： GOD-POD法 ； 加入物加入物 空白管空白管 S( S(标标) U) U1 1( (测测) U) U2 2( (测测) ) DDW 10ul - - - DDW 10ul - - - 5mmol/L( 5mmol/L(糖标糖标) ) - 10ul - 10ul - - - - 待测血清待测血清 - - 10ul 10ul - - 10ul 10ul 试剂（酶酚）试剂（酶酚） 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 混匀后置混匀后置370C370C水浴水浴15min,15min,于于505nm505nm处比色，空白管调处比色，空白管调零，读取吸光度值。

零，读取吸光度值O-T法 (邻甲苯胺法) ；n n加入物加入物 空白管空白管 S( S(标准管标准管) U) U 1 1( (测测) U) U2 2( (测测) ) DDW 0.1ml - - - DDW 0.1ml - - - 5mmol/L5mmol/L糖标糖标 - 0.1ml - - - 0.1ml - - 待测血清待测血清 - - 0.1ml 0.1ml - - 0.1ml 0.1ml 邻甲苯胺试剂邻甲苯胺试剂 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 混匀后放入沸水中煮沸混匀后放入沸水中煮沸5min5min，取出置冷水中冷却，取出置冷水中冷却3min3min，于，于630nm630nm处比色，以空白管调零，读取吸光度值。

处比色，以空白管调零，读取吸光度值五、结果计算n n 测定管吸光度测定管吸光度n n血清葡萄糖血清葡萄糖= × 5mmol/L= × 5mmol/Ln n 标准管吸光度标准管吸光度n n【参考范围】【参考范围】n n空腹：空腹：3.893.89～～6.11mmol/L6.11mmol/L；餐后；餐后2h2h：＜：＜7.8mmol/L7.8mmol/L数据处理1 1．设对比方法测定结果为．设对比方法测定结果为X X值，候选方法测定结果为值，候选方法测定结果为Y Y值若有若有n n个标本，则有个标本，则有2n2n对对X X和和Y Y的测定结果的测定结果2 2．离群点检查：先计算每一标本每一方法成对结果的差．离群点检查：先计算每一标本每一方法成对结果的差值和差值的均值以值和差值的均值以4 4倍的各方法差值的均值为判断限，倍的各方法差值的均值为判断限，各方法内标本的成对差值都应在限值内，说明双份测定各方法内标本的成对差值都应在限值内，说明双份测定结果符合要求。

结果符合要求 若有若有1 1点离群点，剔除若原数据仅为点离群点，剔除若原数据仅为4040例病人标例病人标本的结果，剔除的数据应另做实验补上有一点以上离本的结果，剔除的数据应另做实验补上有一点以上离群点，需查原因，判断是否保留数据无法找出原因，群点，需查原因，判断是否保留数据无法找出原因，则保留使用所有数据，不能随意剔除若最大差异超过则保留使用所有数据，不能随意剔除若最大差异超过临床允许误差，应从仪器、试剂、方法上寻找原因，停临床允许误差，应从仪器、试剂、方法上寻找原因，停止继续实验止继续实验3 3．绘制散点图：以．绘制散点图：以X X轴代表对比方法的测定值，轴代表对比方法的测定值，Y Y轴代表轴代表被评价方法的测定值，图中标出斜率为被评价方法的测定值，图中标出斜率为1 1通过零点的直通过零点的直线4 4．如果实验结果线性关系良好，继续处理如果呈非线．如果实验结果线性关系良好，继续处理如果呈非线性趋势，则需要观察是否有部分呈线性关系，寻找修正性趋势，则需要观察是否有部分呈线性关系，寻找修正点，使余下的部分具线性趋势但应考虑这部分是否包点，使余下的部分具线性趋势但应考虑这部分是否包括了临床上有用的范围，是否需再多做一些在此范围的括了临床上有用的范围，是否需再多做一些在此范围的标本结果。

如去掉非线性部分后，范围过小，无应用价标本结果如去掉非线性部分后，范围过小，无应用价值，则停止评价值，则停止评价 5 5．．X X、、Y Y配对值离群点检查：将每一个标本两个方法的配对值离群点检查：将每一个标本两个方法的前后两个测定值一一对应，求出第前后两个测定值一一对应，求出第i i个个X X与第与第i i个个Y Y的差值，的差值，并计算出所有标本总的平均差值，以并计算出所有标本总的平均差值，以4 4倍的平均差值为倍的平均差值为判断限值所有差值都不应超出限值若有离群点，按判断限值所有差值都不应超出限值若有离群点，按步骤步骤2 2中的方法处理中的方法处理6 6．统计学处理及误差分析．统计学处理及误差分析 直线回归分析：对上述直线回归分析：对上述n n个标本，个标本，2n2n对（对（XijXij、、YijYij））数据以回归方程式数据以回归方程式y y＝＝a+bxa+bx表示a a为回归直线在为回归直线在Y Y轴上轴上的截距，的截距，代表恒定误差的大小代表恒定误差的大小；；b b为回归系数，即直线为回归系数，即直线的斜率，的斜率，代表比例误差的大小代表比例误差的大小。

a和b的计算公式分别为：如果两方法表示的某分析物量具相同的计量单位时，理想状态的回归式应为y＝x，即b=1，a=0b≠1，a≠0分别表示两方法间的测定标本时的比列误差和恒定误差相关性分析：相关系数r= 求出的相关系数还应作相关系数的求出的相关系数还应作相关系数的t t检验相关系检验相关系数数(r)(r)的的t t检验统计学公式是：检验统计学公式是： 将方法比较试验的原始数据将方法比较试验的原始数据 ( (x x和和y y值值) ) 求得的相关系求得的相关系数数r r及例数及例数( (n n) )代入代入t t检验的统计学公式，即可求出相应检验的统计学公式，即可求出相应的的t tr r值，再按照值，再按照n-2n-2的方法计算出自由度的方法计算出自由度( (v v) )，查，查t t值表值表求得求得t0.05(v)t0.05(v)及及t0.01(v)t0.01(v)相应的相应的t t值，若值，若t tr r＞＞t0.05(v)t0.05(v)，，P P＜＜0.050.05，说明实测的相关系数，说明实测的相关系数( (r r) )与与0 0之间差异显著，之间差异显著，两种测定方法的测定结果之间存在相关关系；若两种测定方法的测定结果之间存在相关关系；若tr tr＞＞t0.01(v)t0.01(v)，，P P＜＜0.010.01说明实测相关系数说明实测相关系数( (r r) )与与0 0之间有非之间有非常显著的差异，两种方法的测定值之间存在着高度相常显著的差异，两种方法的测定值之间存在着高度相关关系。

关关系方法比较试验的数据属于配对资料，因而可 作配对资料的t检验n n差值标准差差值标准差 (Sd) ＝＝自由度自由度(V)＝＝n-1 差值标准差中的差值标准差中的d代表候选方法与参考方法测定值代表候选方法与参考方法测定值的差值，为差值之平均值，的差值，为差值之平均值，n为配对数为配对数 判断：若求得判断：若求得t值值＞＞t0.05(v)，即，即P＜＜0.05，表示候，表示候选方法存在显著的系统误差选方法存在显著的系统误差六、注意事项1 1．对比方法的选择十分重要，一般应选参考方法，．对比方法的选择十分重要，一般应选参考方法，这样方法间的任何分析误差均可归于被评价的候选这样方法间的任何分析误差均可归于被评价的候选方法在整个实验中，保持候选方法和比较方法都方法在整个实验中，保持候选方法和比较方法都处于完全质量控制下，始终对实验结果有校准措施处于完全质量控制下，始终对实验结果有校准措施2 2．实验时间至少做．实验时间至少做5 5天，时间长一些更好；标本至少天，时间长一些更好；标本至少选择选择4040份病人，多一份更好实验的可靠性和有效份病人，多一份更好实验的可靠性和有效性随时间延长和更多的标本量而增加。

尽可能使性随时间延长和更多的标本量而增加尽可能使50%50%的实验标本内分析物含量不在参考区间内，各的实验标本内分析物含量不在参考区间内，各个标本内分析物含量分布越宽越好个标本内分析物含量分布越宽越好3．最好使用当天采集的标本，若需保存标本，应确保它们的稳定性只使用一种保存条件，能符合两个方法的要求，以免条件不一引出新的变异4．方法学比较试验时，随时将实验数据点在分布图，发现异常值即复做，及时纠正，可减少离群值出现的机会5.实验方法 在做双份第二次实验时，标本顺序全部倒过来，应在4h内完成测定七、方法学评价 对比资料的相关系对比资料的相关系(r)(r)常用来表示两个变量间互相关常用来表示两个变量间互相关系密切的程度，并不能指明有无恒定误差和比例误差系密切的程度，并不能指明有无恒定误差和比例误差直线回归统计时，除了所有实验点和回归线间的离散直线回归统计时，除了所有实验点和回归线间的离散度会影响度会影响r r值的大小外，实验点对应的分析物含量分值的大小外，实验点对应的分析物含量分布宽度也会明显影响布宽度也会明显影响r r值的大小若实验点过于密集，值的大小若实验点过于密集，尽管离散度不大，但尽管离散度不大，但r r值偏小。

因此，可用值偏小因此，可用r r检验检验X X取值取值范围是否适当一般要求范围是否适当一般要求r≥0.975 r≥0.975 （或（或r2≥0.95r2≥0.95），），认为认为X X范围是适合的若范围是适合的若r r＜＜0.9750.975，应收集更多标本，应收集更多标本再继续实验，使数据分布范围增大依据再继续实验，使数据分布范围增大依据r r值大小来值大小来判断两种比较方法分析结果符合程度时应持谨慎态度，判断两种比较方法分析结果符合程度时应持谨慎态度，相关系数好，但斜率和截距仍然受离群值和非线性以相关系数好，但斜率和截距仍然受离群值和非线性以及数据分布范围的影响及数据分布范围的影响八、可接受性判断 评价实验完成以后，应写出书面报告，确定方法评价实验完成以后，应写出书面报告，确定方法评价的结论候选方法可否被接受，最后根据评评价的结论候选方法可否被接受，最后根据评价实验中的误差结果进行归纳，作出判断根据价实验中的误差结果进行归纳，作出判断根据“ “可允许误差的可允许误差的95%95%限度限度” ”，计算各项误差与其比较，，计算各项误差与其比较，任何一项指标大于可允许误差都不能被接受。

任何一项指标大于可允许误差都不能被接受 只有在假设所有实验结果是绝对正确的前提下，才只有在假设所有实验结果是绝对正确的前提下，才能进行上述计算为了在适当的样品数下，能以最能进行上述计算为了在适当的样品数下，能以最小的代价取得实验误差测定的最大可靠性，可用可小的代价取得实验误差测定的最大可靠性，可用可信区间判断指标使用可信区间判断指比较复杂，信区间判断指标使用可信区间判断指比较复杂，但能对方法性能提供更客观的决定，起最后判断作但能对方法性能提供更客观的决定，起最后判断作用 评价报告中除了要叙述操作方法评价报告中除了要叙述操作方法( (包括试剂配包括试剂配制和所用实验器材制和所用实验器材) )以外，应着重写明候选方法的各以外，应着重写明候选方法的各项分析性能指标，要特别重视实验数据的科学整理项分析性能指标，要特别重视实验数据的科学整理和客观陈述实事求是，对候选方法的优点要充分和客观陈述实事求是，对候选方法的优点要充分肯定，对其缺点和存在的问题也要如实指出肯定，对其缺点和存在的问题也要如实指出。