流式细胞仪检测细胞周期操作步骤.docx

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1X106cells/mL以1mL接种于100mmg养皿内24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）特定时间后终止培养，进行下一步的实验收集原培养液，洗后的PBSffi消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中1000rpm离心5min（短时低速离心）弃上清，用1.5ml预冷PBS1000rpm离心5min后去除PBSW细胞悬液内的细胞碎片加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存1000r/min,离心5min将乙醇吸除，力口PBS青洗混匀1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去吸除离心管内PBS力口入200ulPBS和2ul的RNAB(0.25mg/ml)(37℃下孵育30min)加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min将离心管内的细胞过滤（300um尼龙网膜）至含有PBS的EP管中（PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管提前一天网上预约开机（先开仪器后开软件）流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。

检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nma发光源）荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DN粉子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出rile FlolOH*CI■■F L»Mp*j小 口―QU* OH+qNLt. £L，JLr,l，-三* fw irltifur L结果分析Modfit软件分析图片拷贝：直接Ctrl+CFlowjo软件分析1|口叵1F＜：Th二市』宴,I-£>r-v-u-<5calter(FS€...Xl,£3£,l1?RdlittjrsjkJh印L”T工HrlpE.e1p14lI版/hQcBploy®t--lp.ZX\UHI±J^8£明河包因回H回回回阑・■■叵ftwwwl配*r磔CMJ眦SmHbt毋6cHiMMM35ID15^3羽T,LnwlJ'』，n;F—ngrl“足-1-门1iG-创竺I»qpilOE-5♦ActiveX”•Sttlacticf*SC-HLm=0^J6：at7，i,国7^z-itar4Scbtz4r:一1"二Sid.cSfittcr<™t苦@口/39513ICOOSREtMIVPddFlugscents,■困口口&门2丁-he/谆Q'.1SJ-¥：i.g：eiFl-wr■：™t】押鼬/海二口1”W H • R N:1H *d;1TJM2iR ?」■I.EU.1R®」加1冲下.；a-iw*丁段U扣13slH冲倒Jwn:FCM-DN/fi分析1个细胞增殖群时，可将DNA含量分布组方图分为三部分，即G0/1、S、G2IMG0/1和G2M细胞峰的DNA分布均为正态分布，S期可以认为是一个加宽的正态分布检测结果刻录光盘保存关机（先关软件后关仪器，关机前需清洗）正常细胞DNA^量：2n-4n凋亡细胞：核内DN幽裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丢失，胞内DN蛤量减少。

PI染色后，荧光强度减小而形成一个DN蛤量小于2n的分布区（亚G1峰）昌・・rTlFkKjy Mod*： FiBvkE id p 4 4XleM 1M.OO 工DpGV S3 Ki \ di S3 56Op GZ 星 H4 , ** FT 7?f ・科 R '!；?H4V 1 U4忸 CV 4 3 口T-o^l 与12# '!■> 52、MUlg< 口 >3014& hRW*x \ M ti» i>.* CX4WA)■1* C.1fr 丸Mad oc ed 口，tiri揖 3"45Ah匚产Iq cY*?ti 3"白言Cyc !UK/临 pq「£•，三「oj £ 口ACS; 0.M11、纵坐标CellNumber：即计数的有效细胞数；2、横坐标DNAContent:即DN蛤量；3、G1、G2、S三期在图中已经标示；4、右侧数字含义：DipG1-53.84%at55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56;53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%;DipG2-5.64%at107.72,即G2期DN蛤量平土匀值为107.72,5.64%^PG2期细胞数占总数的5.64%;AnnexinV-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡基本原理：磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素V（AnnexinV）发生特异结合；PI是核酸荧光染料，不能透过正常细胞膜，只能进入已经破损的细胞膜，在嵌入双链DNA后释放红色荧光，荧光强度与PI结合量呈良好的线性关系。

正常细胞：膜完整，PS不外翻一一PI-/AnnexinV-凋亡早期：膜完整，PS翻转——PI-/AnnexinV+凋亡晚期：PS外翻，膜通透，性增加一一PI+/AnnexinV+坏死细胞：膜严重破损，PS不外翻——PI+/AnnexinV+几乎不存在膜结构PI+/AnnexinV-实验步骤：取对数生长期的细胞，按1X106cells/mL以1mL接种于培养皿内24h后，进行所需的处理（比如加入药物）特定时间后终止培养，进行下一步的实验细胞用0.25%夷酶37c消化5min（胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳性）加入PBS制成细胞悬液（移液枪吹打6-8次）倒置显微镜下观察细胞状态（单个分离悬浮）将细胞悬液移入15ml离心管中2000rpm离心5min,PBS吸除用PBS清洗细胞2次（2000rpm,离心5min收集细胞）用400ul1xBindingBuffer悬浮细胞（浓度大约为1X106cells/ml）在细胞悬液中加入5ulAnnexinV-EGFP,轻轻混匀后于2-8C避光条件下孵育15min加入10ulPI后轻轻混匀，于2-8C避光条件下孵育5min在1h内用流式细胞仪检测流式细胞仪激发光波长采用Ex.=488nm双波长激发，Em.二510nm检测EGF限光(FL1channel)和＞575nm的发射波长检测PI。

细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞(包括极晚期凋亡细胞)有绿色和红色荧光双重染色把工一^图2-5-2细胞嗣亡的AnnexinVFITCPI检测法在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为(AnnexinV-/PI-);右上象限是非活细胞，即坏死细胞为AnnexinV+/PI+;而右下象限为凋亡细胞，显现AnnexinV+/PI-。