实验六TPPA检测梅毒螺旋体抗体和TRUST检测课件.ppt

实验六六 TPPA检测梅毒螺旋体抗体和梅毒螺旋体抗体和TRUST检测反反应素素医学医学检验系系临床微生物免疫床微生物免疫检验教研室教研室何何应中中1BG一、目的及要求一、目的及要求掌握掌握：凝集法的基本原理和TPPA检测梅毒螺旋体抗体的 实验原理 熟悉熟悉：：TRUST检测反应素的原理，TPPA的操作方法和结 果判定 了解：了解：TRUST的操作及结果判断，TPPA和TRUST的注意事 项及临床意义 2BG二、基本概念二、基本概念1.直接凝集反应：细菌、螺旋体、红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与下可直接与相应抗体结合出现肉眼可见的凝集现象 2.间接凝集反应：先将可溶性抗原(或抗体)吸附于适当大小的颗粒性载体表面，然后与相应抗体(或抗原)反应，在适当电解质参与下，出现特异性凝集现象 3BG基本概念基本概念 凝集反应是一种定性检测方法，根据凝集现象出现与否判定结果是否阳性或阴性，但也可做半定量检测，即将待测样本作一系列倍比稀释后进行反应，以出现凝集反应的最高稀释度为效价 4BG基本概念基本概念 梅毒螺旋体(treponema pallidum,TP)引起全身性慢性传染病--梅毒，主要通过性交传染。

TP进入人体后，可产生两种抗体，一种是非特异性抗心拟脂抗体(又称反应素)，可用牛心拟脂检测，称非梅毒螺旋体抗原血清反应；另一种是抗梅毒螺旋体抗体，可用梅毒螺旋体检测出来，称梅毒螺旋体抗原血清反应 5BG 本次实验以梅毒螺旋体被动颗粒凝集试验(treponema pallidum passive particle agglutination test，TPPA)检测梅毒螺旋体抗体和梅毒甲苯胺红不加热血清试验(syphilis toluidine red untreated serum test，TRUST)检测血清中的反应素6BG三、梅毒螺旋体被三、梅毒螺旋体被动颗粒凝集粒凝集试验 (treponema pallidum passive particle agglutination test，，TPPA)检测梅毒螺旋梅毒螺旋体抗体体抗体7BG（一）（一）实验原理原理 TPPA是将梅毒Treponema Pallidum(Nicho1s株)的精制菌体成分包被在人工载体明胶粒子上这种致敏粒子和样品中的梅毒螺旋体(TP)抗体进行反应发生凝集，产生粒子凝集反应(Particle Agglutination Test；PA法)，由此可以检测出血清或血浆中的梅毒螺旋体(TP)抗体，并且可用来测定抗体效价。

8BG（二）（二）试剂和器材和器材 1. 梅毒螺旋体抗体诊断试剂(凝集法) 包括溶解液、血清稀释液、致敏明胶粒子(冻干粉)、未致敏粒子(冻干粉)、阳性对照血清等，有商品供应2. 待测血清 临床筛选获得3. 器材 U型微量反应板、可调移液器(10～100μl, 100～1000μl)、加样吸嘴、刻度滴管、25μl微量滴管、平板混合器、判定用观察板等9BG（三）操作方法（三）操作方法 1．1％致敏粒子和1％未致敏粒子的配制：分别加入一定量的溶解液溶解混匀即可请在使用前30分钟于室温(15～30℃)下进行配制2．用移液器加入血清稀释液100μl于U型微量反应板第1孔中，从第2孔至第6孔各加入25μl10BG操作方法操作方法3．用移液器取样本25μl至第1孔中混匀，然后用移液器从第1孔吸取25μl于第2孔中混匀，再从第2孔中吸取25μl于第3孔中……依次类推，以2N的方式从第1孔稀释至第6孔4．用试剂盒中提供的滴管或移液器在第3孔中滴入1滴(25μl)未致敏粒子，从第4孔至第6孔各加入1滴(25μl)致敏粒子11BG操作方法操作方法5．用平板混合器(或用手轻轻撞击敲动)以不会导致微量反应板孔内容物溅出的强度混合30秒钟，加盖后于室温(15～30℃)下水平静置2小时后或次日，在观察镜上记录并观察其反应图像，或者利用免疫稀释判定装置进行测定。

见表312BG操作方法操作方法表表3 凝集法操作步凝集法操作步骤Well No. 1 2 3 4 5 6血清稀释液(ul) 100 25 25 25 25 25 待测血清(ul) 25 25 25 25 25 25 25未致敏粒子(ul) 25致敏粒子(ul) 25 25 25最终稀释倍数 1:40 1:80 1:160 1:320 混匀，加盖后置室温(15～30℃)水平静置2小时或过夜，观察反应判定结果13BG（四）（四）结果判断果判断 1.1.反反应图像判定像判定 在判定用观测板上静置微量反应板，观察粒子的反应图像将反应图像与介质对照图像进行比较，并参照表4进行判断。

14BG表表4 4 凝集法反凝集法反应图像判定像判定 反应图像 判定粒子成纽扣状聚集,呈现外周边缘均匀且平滑的圆形 (－)粒子形成小环状,呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形 (±±)粒子环明显变大,外周边缘不均匀且杂乱凝集在周围 (＋＋)产生均一的凝集,凝集粒子在底部整体上呈膜状延展 (++++)结果判断果判断15BG阳性：未致敏粒子最终稀释倍数1:40的反应图像判定为 (－)，致敏粒子最终稀释倍数1:80以上的反应图 像判定为(＋)，即最终判定为阳性，并将显示反 应图像为(＋)的最高稀释倍数作为抗体效价阴性：无论未致敏粒子呈现何种反应图像，只要致敏粒 子最终稀释倍数1:80的反应图像显示为(－)时， 最终判定为阴性结果判断果判断2 2．．结果判定果判定标准准16BG可疑：未致敏粒子最终稀释倍数1:40的反应图像判定为 (－)且致敏粒子最终稀释倍数l:80的反应图像判 定为(±)时，最终判定为可疑。

注意！！！通过本试剂判定为抗体阳性或可疑的，经过 一段时间再进行复查，并与其他检查结果和临床 症状结合起来加以综合判断结果判断果判断17BG（五）注意事（五）注意事项 1.致敏粒子及未致敏粒子在使用前均应充分混匀2.试验在滴加致敏粒子后反应板中液体须充分混匀后才能静置3.反应静置过程中，反应板一定要加盖并禁止振摇4.用本试剂判定结果为可疑时，请使用其他检查方法(FTA-ABS法等)18BG5.本试剂用来测定样品中的梅毒(TP)抗体效价，而不是直接用来测定TP在判定为抗体阳性的情况下，请结合其他检查结果及临床症状进行综合判断6.应注意血清凝集法免疫反应中可能发生的前带现象注意事注意事项19BG7.TP感染初期，有可能不产生抗体，或产生抗体但数量很少的情况如果已被怀疑为感染时，即使本试剂的判定结果为阴性，也要经过一段时间再进行检查并与其他检查(使用梅毒脂质抗原进行检查，FTA-ABS试验等)结果和临床症状结合起来加以综合判断注意事注意事项20BG8．服用含有免疫球蛋白血液制剂的患者样品，有可能因服用制剂而呈阳性反应，应注意做出准确判定9．待测样品可能存在HBV，HCV，HIV等，因此对待测样品及使用过的器具应按二级实验室生物安全处理(用次氯酸钠浸泡和＞121℃高压蒸汽灭菌l小时以上)。

注意事注意事项21BG10.本试剂的溶解液、血清稀释液和阳性对照血清含有叠氮钠防腐剂故在废弃时要用大量水冲洗，以避免生成具有爆炸性的金属叠氮11.若发生试剂误溅入口中或眼里，应立即用大量清水冲洗，必要时到医院就诊注意事注意事项22BG四、梅毒甲苯胺四、梅毒甲苯胺红不加不加热血清血清试验 (TRUST)(TRUST)检测反反应素素23BG（一）（一）实验原理原理 用牛心拟脂抗原吸附于特制甲苯胺红上制成致敏粒子，当这种致敏粒子与样本血清作用时，若样本中含有抗心拟脂抗体(反应素)结合，形成肉眼可见的红色凝集反应24BG（二）（二）试剂和器材和器材 1.梅毒甲苯胺红不加热血清试验诊断试剂(TRUST) 包括TRUST抗原悬液、阴阳性对照血清、试验专用卡片、专用滴管及针头有商品供应2.0.9％生理盐水3.待测血清 临床筛选获得4.器材 可调移液器(10～100μl)、加样吸嘴、冰箱等25BG（三）操作方法（三）操作方法 1 1．定性．定性试验(1)分别吸取梅毒阳性对照、阴性对照和待检血清或血 桨(不需灭活)50μl均匀铺加于纸卡的三个圆圈中。

2)用专用滴管及针头垂直分别滴加TRUST试剂1滴于上 述血清中3)按100r/min摇动8min，肉眼观察结果26BG操作方法操作方法2 2．定量．定量试验 将待检血清用生理盐水作倍比稀释，然后按上述定性方法进行试验，以呈现明显凝集反应的最高稀释度作为该血清的凝集效价27BG（四）（四）结果判断果判断 1.阳性反应(+++～++++)：可见中等或较大的红色凝聚物2.弱阳性反应(+～++)：可见较小的红色凝聚物3.阴性反应(－)：可见均匀的抗原颗粒而无凝聚物28BG（五）注意事（五）注意事项 1.本试验在23～29℃条件下进行2.TRUST试剂使用前应充分摇匀3.本试验系非特异性反应，需结合临床进行综合分析，必要时需作梅毒螺旋体抗体特异性试验29BG五、五、实验讨论与思考与思考题 凝集反应只有在抗原抗体比例适当时，才能出现肉眼可见的反应一般情况下，随着血清浓度的逐渐稀释，凝集反应越来越弱，但在抗体浓度过高时，反而无凝集现象出现，此为前带现象出现该情况时，须加大抗体稀释倍数重新试验30BG 实验方法学评价：①由于抗原抗体反应的血清学试验方法检测灵敏度具有一定的局限性，所以本试剂检测结果只能提示血清或血浆中有无TP抗体存在，而不能作为临床诊断的唯一标准。

②TP抗体检测阴性的样品并不能排除梅毒感染的可能实验讨论与思考与思考题31BG 通过本试剂判定为TP抗体阳性或可疑时，需经过一段时间再进行复查，并与其他检查结果和临床症状结合起来加以综合判断1.TRUST和TPPA是否是特异性实验？为什么？2.TPPA阳性可以确诊Treponema Pallidum吗？TPPA阴性可以排除Treponema Pallidum诊断吗？为什么？实验讨论与思考与思考题32BG下次下次课预习内容内容实验三 设计性实验 设计性实验的开题报告和技术路线 33BG34BG。