HRP基础知识.doc

HRP基础知识辣根过氧化物酶 科技名词定义中文名称：辣根过氧化物酶 英文名称：horseradish peroxidase;HRP 定义：编号：EC 1.11.1.7一种糖蛋白，由于在辣根中该酶的含量很高，故名它以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合通常用做光学和电子显微镜的组织化学示踪物 所属学科： 生物化学与分子生物学(一级学科) ；酶(二级学科) 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录[隐藏]简介 制备 1. 实验原理 2. 仪器和试剂 3. 操作步骤简介 制备 1. 实验原理 2. 仪器和试剂 3. 操作步骤　　 [编辑本段]简介　　过氧化物酶，酶学分类号为EC 1.11.1.7该酶催化 　　Donor+ H2O2--→Oxidized donor+2 H2O 　　过氧化物酶，通常来源于辣根（因此称辣根过氧化物酶），是临床检验试剂中的常用酶该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响 　　辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。

HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)RZ值越小，非酶蛋白就越多 [编辑本段]制备实验原理　　过氧化物酶催化以下反应： 　　2 H2O2 ─→ O2＋2H2O 　　这一类酶以铁卟啉为辅基，所以属血红素蛋白质类(hemeProteins)过氧化物酶在生物界分布极广，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用 　　本实验是以辣根为原料，经过水的抽提，硫酸铵和丙酮分级分离，再经锌离子纯化，透析除盐，冷冻干燥，最后制得高纯度的辣根过氧化物酶 　　辣根过氧化物酶分子量在40，000左右，是一种含亚铁血红素的蛋白质，等电点7.2；易溶于水，溶解度为5％(W/V)，溶液呈棕红色，透明；也溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而0.62饱和度以上则不溶。

该酶最适pH为7.0(对愈创木酚为氢给体而言)在室温下HRP在几周内保持稳定，加热到63℃后15分钟内稳定 　　辣根过氧化物酶氧化还原电势很低，pH6.08时，E’0＝ -0.2070v；pH为7.71时，E’0＝ -0.5787v 　　辣根过氧化物酶的作用机理可分以下几步： 　　第一步，形成绿色有活性的酶一底物复合物Ⅰ： 第一步　　第二步，复合物Ⅰ转变成红色有活性的复合物Ⅱ： 　　复合物Ⅰ＋AH──→复合物Ⅱ＋A 　　第三步，复合物Ⅱ被还原，释放出酶： 第三步　　AH：表示还原型氢供体 　　在一定程度上复合物II可自发地分解成HRP和产物(P)，亦可与过量的过氧化氢形成无活性的复合物Ⅲ 　　 　　 　　辣根过氧化物酶的活力测定方法有多种，主要原理介绍如下： 　　1、Rz值，提纯工作的后几步以及纯酶溶液可用Rz值表明酶的纯度 　　 　　403nm处的吸收代表血红素辅基的吸收，275nm的吸收是蛋白质的吸收，结晶的HRP的Rz值为3.04测定时的酶浓度为1毫克蛋白／毫升 　　2、愈创木酚法：测k4［见反应式(3)］以愈创木酚(邻甲氧基酚，guaiacol)为氢给体，其反应如下： 　　 　　四邻甲氧基连酚有色产物四邻甲氧基连酚(E470nm = 26.6mM－1cm－1)生成的速度(dx／dt)与底物过氧化氢以及氢供体愈创木酚的浓度有关。

方程如下： 　　 　　e—酶浓度； 　　α0—氢供体起始浓度； 　　x0为过氧化氢的起始浓度 　　如果测定的条件选择成k4α0》k1x0，可以测得k1： 　　 　　所以 　　所以： 　　 　　 —测定过程中底物减少的速度 　　本实验是采用测定k4的方法来判断酶的纯度 　　上述测定Rz值和k4值的方法虽然比较简单，但都不能测得酶的实际活力单位测定过氧化物酶的传统方法是连苯三酚试验法，以过氧化氢为底物，在酶作用下，连苯三酚可形成红棓酚(Purpurogallin)，在430nm处测定产物的形成用红棓酚值(PZ)表示酶的活力PZ表示在标准测定条件下1毫克酶所形成的红棓酚微克数 仪器和试剂　　仪器 　　离心机、干燥器、分光光度计 　　试剂 　　1. 硫酸铵：工业纯和化学纯； 　　2. 丙酮 　　3. 10mM pH7.0磷酸盐缓冲液：称取243.5毫克磷酸二氢钠(NaH2PO42H2O)和857毫克磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)，溶于400毫升水中 　　4. 20mM愈创木酚溶液：取0.22毫升愈创木酚加水至100毫升 　　5. 40mM过氧化氢溶液：取0.4毫升30%过氧化氢加水至100毫升(如测k1则用10mM过氧化氢溶液)。

临用前配制 　　6. 5％乙酸钡溶液 　　7. 奈氏试剂 　　8. 0.1 mol/L硝酸银溶液 操作步骤　　(一)HRP的制备 　　1.水提取： 　　称取 10斤用水冲刷干净的鲜辣根(辣根皮中亦含有丰富的HRP)，用菜刀切成小碎块，在搅肉机中搅碎1~2次碎渣浆用1倍体积的水在低温下搅拌提取过夜(亦可采用高速抽提法)次日用甩干机(或离心机)甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取一次，合并两次滤液，量总体积和度，0 　　2.硫酸铵分级分离： 　　在不断搅拌下，每升滤液中慢慢加入226克硫酸铵粉末(相当于0.40饱℃)，大约在1~2小时内加完，置冷室中放置过夜次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面浑浊液以3000转/分离心15分钟，弃沉淀，合并上清液再按每升上清液加258克硫酸铵粉末(0.8饱和度)随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离心机中以13000转/分离心20分钟，弃去上清液，收集沉淀将沉淀悬浮于100~150毫升蒸馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止)，分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析1~2天，直到硫酸铵透析完毕为止(可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查)。

然后改换成用蒸馏水透析，中间更换2~3次，用0.1 mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止 　　将透析液合并，在冰冻离心机中以 4000转/分离心 15分钟；弃去沉淀，量上清液的体积 　　3.丙酮分级分离： 　　将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至-15℃的丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4，000/分离心15分钟，弃去沉淀上清液再加入0.8体积(按原上清液体积)-15℃丙酮，(操作同上)，静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除丙酮可得Rz值近于1的酶溶液 　　4.精制： 　　将上步酶液适当稀释，滴加1M硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10-3M，5000转／分离心10分钟，得上清液再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，对水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冷冻干燥(约得20毫克)，产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的Rz值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存 　　(二)HRP的活力测定 　　1.活力测定：测定k4值的方法操作如下： 　　取2个比色池(带盖，光程1厘米)，按下表加入反应物 　　 　　*酶液：将1毫克蛋白/毫升的酶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍后应用。

　　加好反应物，摇匀，在470nm 读出OD值，为t=0 的读数立即加0.01毫升40mM过氧化氢溶液于2个比色池中，即刻摇匀并记时，每隔30秒钟读数一次，约5分钟并记下实验时的室温 　　将所测样品的OD值减去相应时间对照的OD值，然后以OD值为纵坐标，时间为横坐标作图得一直线，计算出平均每分钟光密度的增加值，即求出△x/△t，按公式(8)求出k4值实际的实验值k4 = 2.210，k4 = 3.110，而k4 应当为3.310该方法用于测定粗的无细胞提取液误差较大 　　因为某些物质可干扰四邻甲氧基连酚的形成 　　或不求k4值，而把在上述条件下，每分钟OD470增加0.001所需酶量定为1个HRP活力单位 　　2.蛋白质含量的测定： 　　将酶液适当稀释后，用 Folin一酚试剂法比色测定蛋白质含量5 / 5。