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确定NTS内参与心脏伤害性感受的谷氨酸受体亚型 　　位于延髓的孤束核（ｎｕｃｌｅｕｓ　ｔｒａｃｔｕｓ　ｓｏｌｉｔａｒｉｕｓ，ＮＴＳ）在心血管、呼吸以及胃肠道的初级感觉信息的整合和传递中扮演重要的角色心脏伤害性感受信息主要由伴随心交感神经和心迷走神经的传入纤维传递，经不同的传入通路上传到中枢引起相应的反应解剖学研究表明：　　ＮＴＳ既是心迷走神经传入的中枢投射部位，同时也是心交感神经的中转部位ＮＴＳ在伤害性信息的传递中扮演不同的角色，既有抑制作用也有易化作用，但ＮＴＳ对心脏伤害性感觉信息的作用到目前为止尚不清楚　　谷氨酸是ＮＴＳ内主要的兴奋性神经递质，谷氨酸受体分为２大类：一类为离子型受体，包括Ｎ－甲基－Ｄ－天 冬 氨 酸 （Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ａｓｐａｒｔｉｃ　 ａｃｉｄ，ＮＭＤＡ）型、α－氨 基－３－羟 基－５－甲 基－４－恶 唑－丙 酸（α－ａｍｉｎｏ－３－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｉｓｏｘａｚｏｌｅ　ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ，ＡＭＰＡ）型和海人藻酸（ｋａｉｎｉｃ　ａｃｉｄ，ＫＡ）型，后２种也统称为非ＮＭＤＡ受体，其与离子通道偶联，形成受体－通道复合物，介导快信号或快突触传递；另一类为促代谢型谷氨酸受体（ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ　ｇｌｕｔａｍａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ｍＧｌｕＲｓ），其与膜内的Ｇ－蛋白偶联，被激活后通过Ｇ－蛋白效应器酶、胞内第二信使等组成的信号转导系统起作用，产生包括慢突触传递等较缓慢的生理反应。

　　ＮＭＤＡ受 体 和ｍＧｌｕＲｓ参与痛觉过敏， 但ＮＴＳ内谷氨酸及其受体亚型在心脏伤害感受中的作用尚不清楚辣椒素是伤害性感受神经元的选择性激活物质，可以选择性地作用于有伤害性感受作用的Ｃ和Ａδ神经纤维末梢研究表明：心脏表面给予辣椒素可以激活伴随迷走和交感神经的传入纤维，心包内注射辣椒素可以诱发心脏－躯体运动反射 （ｃａｒｄｉｏｓｏｍａｔｉｃ　ｍｏｔｏｒ　ｒｅｆｌｅｘ，ＣＭＲ），背斜方肌肌电（ｅｌｅｃｔｒｏｍｙｏｇｒａｍ，ＥＭＧ）活动明显增强本研究利用心包内注射辣椒素诱发的ＣＭＲ为心脏伤害性感受指标，于ＮＴＳ内分别微量注射谷氨酸及各受体亚型拮抗剂观察其对ＣＭＲ的影响，确定ＮＴＳ内参与心脏伤害性感受的谷氨酸受体亚型，旨在为ＮＴＳ内参与心脏伤害性感受信息调控的神经递质和受体提供新的证据　　１材料与方法　　１．１　主要试剂和仪器 辣椒素溶于吐温８０和无水乙醇（按１∶１比 例 混 合）溶 液 中，配 制 成１１０ｇｍＬ－１的贮存液，实验时用生理盐水稀释到所需浓度１ｍｇＬ－１鹅膏蕈氨酸（ｉｂｏｔｅｎｉｃ　ａｃｉｄ，ＩＢＯ）、谷氨酸、ＮＭＤＡ受体拮抗剂［（＋）－ＭＫ－８０１ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｍａｌｅａｔｅ，ＭＫ－８０１］、非ＮＭＤＡ受 体 拮抗 剂６，７－二 硝 基 喹 喔 啉－２，３二 酮 （６，７－ｄｉｎｉｔｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ－２，３－ｄｉｏｎｅ，ＤＮＱＸ）均 用 生 理盐水溶解。

　　ｍＧｌｕＲｓ拮抗剂α－甲基，４－羧基苯丙氨酸 ［（ＲＳ）－ａ－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｃａｒｂｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ，ＭＣＰＧ］先用ＮａＯＨ（１ｍｏｌＬ－１）溶解后，再用生理盐水稀释，所有药物最终的ｐＨ值调整为７．２～７．６，所用药物均购自美国Ｓｉｇｍａ公司　　ＢＬ－４２０生物信号采集与分析系统（成都泰盟生物科技有限公司），压力换能器（成都泰盟生物科技有限公司），蠕动泵（ＢＴ１００－２Ｊ，保定兰格恒流泵有限责任公司），小动物呼吸机（ＤＷ３０００－Ｂ型，淮北正华生物仪器设备有 限公司），大鼠脑立 体 定 位 仪 （日 本Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ公司），Ｏｌｙｍｐｕｓ生物显微镜（ＢＸ５１，日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公 司 ），０．５μＬ微 量 注 射 器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，Ｎｅｖａｄａ，ＵＳＡ）　　１．２　实验动物、动物分组及处理方法　健康雄性ＳＤ大鼠６０只，体质量２６０～３３０ｇ，将其随机分为ＩＢＯ组、 谷 氨 酸 组、ＭＫ－８０１组、ＭＣＰＧ组、ＭＣＰＧ联合ＭＫ－８０１组和ＤＮＱＸ组；各组大鼠孤束核内分别微量注射１３０ｍｍｏｌＬ－１ＩＢＯ　１００ｎＬ，１０．０、２０．０、５０．０ ｍｍｏｌＬ－１谷 氨 酸１００ ｎＬ，ＮＭＤＡ受体拮抗剂４０和６０ｍｍｏｌＬ－１ＭＫ－８０１１００ ｎＬ，代谢型谷氨酸受体拮抗剂２５和５０ｍｍｏｌＬ－１ＭＣＰＧ　１００ ｎＬ，２５ ｍｍｏｌＬ－１ＭＣＰＧ　５０ｎＬ联合４０ｍｍｏｌＬ－１ＭＫ－８０１５０ｎＬ，非ＮＭＤＡ受体拮抗剂２０和５０ｍｍｏｌＬ－１ＤＮＱＸ１００ｎＬ。

　　１．３　大鼠心包插管术和 ＮＴＳ内微量注射手术大鼠称质量后以初始剂量的戊巴比妥钠 （４５～５５ｍｇｋｇ－１）静脉滴注麻醉取俯卧位，暴露左侧背斜方肌，以记录背斜方肌ＥＭＧ再取仰卧位，行气管插管术，右侧颈动脉插管监测动脉血压，左侧颈静脉插管以便在整个实验过程中维持戊巴比妥钠的麻醉（１０～１５ｍｇｋｇ－１ｈ－１）以动脉血压和瞳孔直径监测实验动物麻醉深度①心包插管术：左侧上胸部第１到第３肋软骨处行开胸术，暴露胸腺中线处分离胸腺，暴露心包膜玻璃分针尖端（直径０．５ｍｍ）在心包膜上扎开１个小孔，将一长１２～１４ｃｍ远端有数个小洞的硅胶管（内径０．０２０ｍｍ、外径０．０３７ ｍｍ）经 此 孔 插 入 心 包 约２ｃｍ，缝合胸腺和各层胸壁组织，以固定心包插管② ＮＴＳ内微量注射：将大鼠固定于脑立体定位仪上，剪开枕骨处头皮，钝性分离附着于枕骨处的肌肉，暴露枕骨微型电钻钻透枕骨后，用咬骨钳剥离部分颅骨，在闩部水平去除硬脑膜和软脑膜实验中药物注射位点以写翮（第４脑室尾侧最后点）为零坐标（相当于前囟后１４．３ｍｍ水平），左侧旁开０．５～０．８ｍｍ，吻侧０～０．５ｍｍ，脑表面下０．５～０．８ｍｍ微量注射使用尖端与玻璃微电极相连的０．５μＬ微量注射器，微电极尖端直径为５０～１００μｍ。

ＮＴＳ内微量注射量为０．１μＬ，速度为０．１μＬｓ－１根据以往研究以及预实验选择药物的剂量　　１．４　ＣＭＲ记录过程同芯电极以３０的角度插入左侧背斜方肌，记录其ＥＭＧ信号，根据肌肉大小调节电极插入深度，插入深度一般为１．５～１．７ｍｍ手术完毕２～３ｈ，待动物状态稳定后记录ＥＭＧ基线活动６０ｓ，ＮＴＳ内微量注射生理盐水１００ ｎＬ，１５ ｍｉｎ后心包腔内注射辣椒素（０．６５５ｎｍｏｌ／０．２ｍＬ）１ ｍｉｎ后 回 抽 并 冲 洗 心 包４～６次，同 时 记 录ＥＭＧ　６０～６５ｓ５０ ｍｉｎ后ＮＴＳ内注射谷氨酸或者谷氨酸受体不同的拮抗剂１００ｎＬ，１５ｍｉｎ后心包腔内注射辣椒素１ｍｉｎ后回抽并冲洗心包，同时记录ＥＭＧ　６０～６５ｓ，观察药物对ＥＭＧ活动的影响间隔１ｈ后心包腔内注射辣椒素０．２ｍＬ，观察ＥＭＧ恢复情况　　ＥＭＧ以反应中的放电单位总数计算，以ＮＴＳ内注射生理盐水后的ＥＭＧ反应为对照，将其定义为１００％计算注射药物后的ＥＭＧ与生理盐水比较的百分比　　ＥＭＧ以反应中的放电单位总数计算，以ＮＴＳ内注射生理盐水后的ＥＭＧ反应为对照，将其定义为１００％；计算注射药物后ＥＭＧ变化的百分比。

实验结束后，ＮＴＳ微量注射位点原位微注射２％膀胺天蓝１００ｎＬ，以标记药物注射位点及扩散范围　　１０ ｍｉｎ后 静 脉 内 注 入 过 量 戊 巴 比 妥 钠（１００ｍｇｋｇ－１）深麻大鼠，经左心室插管至升主动脉，先用５０ｍＬ生理盐水快速灌注冲洗血液，再用约２００ｍＬ　１０％甲醛溶液灌流固定灌流结束后取脑组织，放置于１０％的甲醛固定液中室温固定４ｈ，再转移到２０％的蔗糖溶液中４℃沉糖４８ｈ待组织沉糖完全后进行冰冻切片，片厚３０μｍ，行尼氏染色，显微镜下根据大鼠脑图谱进一步确定注射位点（图１）　　１．５统计学分析 采用ＳＰＳＳ　１０．０统计软件对数据进行分析处理ＥＭＧ变化的百分比以ｘｓ表示，多组间样本均数比较采用单因素重复测量方差分析　　　２结果　　２．１　ＮＴＳ内微量注射ＩＢＯ 后 ＣＭＲ的变化　ＮＴＳ联合部微量注射１３０ｍｍｏｌＬ－１ＩＢＯ　１００ｎＬ，１和２ｈ后ＥＭＧ放电总数分别为 （５６．４６．９）％和（４０．５５．４）％，与 对 照 组 比 较 明 显 下 降 （Ｐ＜０．０１）　　　　２．２　ＮＴＳ 内微量注射谷氨酸后 ＣＭＲ 的变化 ＮＴＳ内分别微量注射１００、２００和５００ｍｍｏｌＬ－１谷氨酸后，ＥＭＧ活动分别为 （１１６．９４．９）％、（１４３．９１０．２）％和 （２１４．２１５．８）％，与生理盐水对照组比较ＣＭＲ均增加 （Ｐ＜０．０５）。

见图３　　２．３　ＮＴＳ内微量注射谷氨酸受体亚型拮抗剂后 ＣＭＲ 的 变 化 　 ＮＴＳ内 微 量 注 射４０和６０ｍｍｏｌＬ－１ＭＫ－８０１　１００ｎＬ后，ＥＭＧ活动分别为 （４５．２１０．６）％和 （３６．８１４．３）％，与生理盐水对照组比较明显下降 （Ｐ＜０．０５）ＮＴＳ内微量注射２５和５０ｍｍｏｌＬ－１ＭＣＰＧ后，ＥＭＧ活动分别为 （６５．２１６．３）％和 （５７．０４．２）％，与生理盐水对照组比较明显下降 （Ｐ＜０．０５）ＮＴＳ内联合微量注射２５ｍｍｏｌＬ－１ＭＣＰＧ和８０ｍｍｏｌＬ－１ＭＫ－８０１后，ＥＭＧ活动为 （２２．５１３．２）％，与单独注射ＭＣＰＧ或者ＭＫ－８０１后比较ＥＭＧ活动明显下 降 （Ｐ ＜０．０５）ＮＴＳ内 微 量 注 射２０和５０ｍｍｏｌＬ－１ＤＮＱＸ后，ＥＭＧ反应为 （９９．６１８．６）％和 （１０４１２．４）％，与生理盐水对照组比较差异无统计学意义 （Ｐ＞０．０５）　　　　３讨论　　以往研究表明：心脏感觉传入神经纤维至少通过２条通路上传到中枢神经系统，即伴随心交感神经的传入纤维和伴随心迷走神经的传入纤维大部分迷走传入神经纤维直接投射到位于延髓的ＮＴＳ。

束路追踪研究表明：心脏交感传入神经纤维通过星状神经节和交感神经链投射到上胸段脊髓背角，而来自脊髓颈部和胸部背角的投射纤维中枢部同样也会终止于ＮＴＳＡｌｂｕｔａｉｈｉ等研究表明：心包内注射化学致痛剂可以诱发ｃ－Ｆｏｓ在ＮＴＳ内的表达这些结果提示ＮＴＳ是心脏伤害性感觉信息传递的重要驿站在本实验中ＮＴＳ联合部微量注射选择性的神经元胞体损毁剂ＩＢＯ，抑制了心包腔内注射辣椒素诱发的ＥＭＧ反应；ＮＴＳ联合部内微量注射兴奋性神经递质谷氨酸以选择性地激活神经元胞体，结果显示谷氨酸对心包内注射辣椒素诱发的ＣＭＲ有明显的易化作用，且呈剂量依赖性的增加关系这２项结果提示：　　ＮＴＳ在心脏伤害性感觉信息的中枢调控过程中起易化作用，且这种易化作用是以谷氨酸作为其兴奋性神经递质的该结果与以往的研究结果一致，解剖学以及电生理学实验研究证明：谷氨酸是ＮＴＳ内重要的兴奋性神经递质，激活ＮＴＳ内神经元可以对伤害性感受产生易化调控作用由于ＮＴＳ同时是心脏伤害性感受的初级传入中枢，对于这种易化作用的产生有２种可能：一种是谷氨酸激活了ＮＴＳ参与的伤害性信息的内源性下行易化调控通路；另外可能是因谷氨酸是 心脏 伤害性感受 初 级 传 入 纤 维 在ＮＴＳ内的神经递质，注射谷氨酸增加了初级传入信息从而产生易化效应。

对于这２种可能性还需进一步的研究证实　　免疫细胞研究以及分子生物学研究证实：　　ＮＭＤＡ受体、非ＮＭＤＡ受体以及代谢型谷氨酸受体亚型在ＮＴＳ内均有表达不同的谷氨酸受体亚型在伤害性感受的作用有所不同研究表明：　　ＮＴＳ内的ＮＭＤＡ受体介导胃内注射盐酸诱发的胃痛觉感受；ｍＧｌｕＲｓ对炎症诱发的脊髓超兴奋的产生是必须的，并且ｍＧｌｕＲ参与痛觉过敏的行为学反应的形成但是，ＮＴＳ内谷氨酸各受体亚型在心脏伤害性感觉信息的调控中。