免疫组化HE染色FISHISH.ppt

现阶段开展的病理实验主要内容：免疫组化HE染色几种特殊的染色原位杂交荧光原位杂交免疫组化 1、免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学 2、我们现阶段主要要做的组织免疫组化有石蜡切片、冰冻切片免疫组化以及荧光免疫组化细胞免疫组化有细胞爬片、细胞印片和细胞涂片免疫组化和荧光免疫组化 3、免疫组化过程中抗原修复有高压修复法、酶修复、微波修复，其中微波修复抗原对提高免疫组化阳性检出率非常有效4、高压修复和微波修复法中常用的缓冲液有0.01M柠檬酸缓冲液、1mM的EDTA（pH8.0）6、酶标抗体系统中的酶与显色剂、复染液的合理选用：（1）辣根过氧化物酶系统（HRP）显色剂一般用DAB、AEC,DAB显色液一般染色部位为棕黄色，AEC显色液一般染色部位为红色；而HRP系统常用的复染液为苏木素，将细胞核染成蓝色2）碱性磷酸酶系统（AP）显色剂一般用BCIP/NBT、固红、固蓝最常用的是BCIP/NBT显色液，染色部位为深蓝色或者蓝紫色；该系统常用的复染液为核固红，将细胞核染成红色。

免疫组化切片组织前期处理1、组织块大小应限于2cm×1.5cm×0.2cm 2、应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求5μm左右，神经组织的研究要求切片厚度在20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行 3、石蜡切片为常规制片技术，切片厚度2～7μm，应用范围广，不影响抗体的穿透性，染色均匀一致 4、组织的固定：4%多聚甲醛固定一般1-2小时固定后经充分的流水冲洗后进行脱水包埋5、组织脱水：主要用不同梯度的酒精进行脱水一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求但是为了能使大量的组织块同时进行脱水，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净6、组织透明：我们一般采用二甲苯透明，30-60min即可5、石蜡切片：浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以熔点低的软蜡较好,浸蜡时间1－4小时 6、冰冻切片：组织采用液氮法包埋将未固定的组织放入OCT包埋剂中对组织进行液氮包埋，包埋后放在-80度冰箱中贮存或者对其进行切片或者将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量，再放入OCT包埋剂中进行包埋。

7、切片的固定：冰冻切片、细胞切片常用固定液为4 ℃丙酮或者4%多聚甲醛，固定10-30min石蜡切片免疫组化•1、石蜡切片脱蜡至水•2、3% H2O2室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶的活性，水洗，5min×3次•3、根据客户抗体要求进行修复，PBS冲洗，2min×3次 •4、5-10% 正常山羊血清封闭（5%BSA封闭20-30min），室温孵育20-30min倾去血清，勿洗•5、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（PBS配制），37℃孵育1-2小时或4℃过夜室温20-30min，再放于37℃孵育20-30min）•6、PBS冲洗，2min×3次•7、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37℃孵育10-30min•8、PBS冲洗，2min×3次•9、滴加即用型SABC，37℃孵育10-30minPBS冲洗，5min×4次•10、显色剂显色（DAB或AEC）•11、自来水充分冲洗，复染（苏木素），脱水透明，封片返回 B石蜡切片免疫组化DAB显色血涂片，细胞，冰冻切片免疫组化1、冰冻切片4-8µm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。

2、室温放置30min后，放入4℃丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30minPBS冲洗5min×3次3、30%过氧化氢1份+纯甲醇50份混合，室温浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶蒸馏水洗2次4、其余步骤和石蜡切片免疫组化4-11步相同注：如果冰冻切片直接染色结果不理想时，可以参照石蜡切片对切片进行热修复，方法和石蜡切片3-11步相同石蜡切片荧光免疫组化•1、 石蜡切片脱蜡至水 •2、与石蜡切片免疫组化3-8的步骤相同•3、加入SABC-FITC, 37℃孵育10-30min，PBS冲洗，5min×4次•4、抗荧光萃灭封片液 封片，荧光显微镜观察冰冻切片荧光免疫组化•1、冰冻切片4-8µm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱•2、室温放置30min后，放入4℃丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30minPBS冲洗5min×3次•3、5-10% 正常山羊血清封闭，室温孵育10-30min倾去血清，勿洗•4、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜•5、PBS冲洗，5min×3次•6、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37℃孵育10-30min；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10-20min。

•7、PBS冲洗，5min×3次•8、滴加SABC-FITC,37℃孵育10-30min，PBS冲洗5min×3次•9、抗荧光萃灭封片液 封片，荧光显微镜观察细胞爬片免疫组化1、取出培养皿，用PBS漂洗2min×2次.2、4℃冷丙酮或4%的多聚甲醛固定的细胞爬片，室温10-30分钟PBS漂洗2min×3次0.5%TritonX-100室温处理20minPBS洗2min×3次，3%过氧化氢室温处理15min，PBS洗2min×3次3、血清封闭：室温 10-30分钟，倾去4、一抗：37℃ 1小时或4度过夜5、0.1M PBS 洗三次------每次三分钟6、相应的生物素化二抗37℃ 30-40分钟7、0.1MPBS 洗三次------每次三分钟8、链酶卵白素-碱磷酶复合物或过氧化物酶标记链酶卵白素37℃ 40min9、NBT/BCIP或DAB显色，核固红或苏木素复染10、切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封片；•注意事项：注意事项：•1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下：•（1） 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上，这样细胞爬片才较牢固，冲洗时不易脱片；•（2） 接种的细胞密度适中，以2*104/ml为宜，若细胞密度太高，5天后细胞连接成片冲洗时易脱片；•2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4度冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或4%多聚甲醛固定。

•3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）•4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜•5、Triton X-100（曲拉通）表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少免疫组化中常用的固定液•1. 冷丙酮 可用于一般的免疫组化染色•将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存•2. 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色 •主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等•室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存•3. 95％乙醇，可用于免疫组化•优点：穿透性强、抗原性保存较好•缺点：醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度•室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存•4. 甲醛(福尔马林)应用最广 •优点：形态结构保存好，且穿透性强，•缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。

可造成假阴性的染色结果返回HE染色 苏木精 — 伊红染色法 ( hematoxylin-eosin staining ，HE)是石蜡切片技术里常用的染色法之一 HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法 HE染色的原理：脱氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染成红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比石蜡切片HE染色步骤：1、脱蜡水合2、蒸馏水洗5min×3次3、苏木素染液染色，镜下控制染色时间4、水洗玻片上多余染液，0.5-1%盐酸酒精分色数秒5、流水冲洗15-30s，细胞核呈蓝色6、0.5%伊红染液染色1-5min蒸馏水浸泡5min7、风干，封片细胞爬片HE染色1、取出细胞爬片，用PBS洗涤3次2、样品固定：95％乙醇固定20min，PBS洗涤2次，每次2min3、其余步骤和石蜡切片3-7步相同冰冻切片HE染色1、固定：固定1-2min。

配制方法：40%福尔马林15 mL，95%乙醇80 mL，冰乙酸5 mL )2、其余步骤和石蜡切片2-7步相同染色结果：染色结果：细胞核呈蓝色，胞浆呈红色，红细胞呈桔红色，其他部位呈深浅不同的红色返 回常用特殊染色一、弹力纤维染色1、弹性纤维主要由弹性蛋白（一种黄色硬蛋白，它是黄色弹性纤维组织的主要成分，干燥时易脆，而湿润时呈弯曲并富弹性）构成新鲜时它呈黄色，固又称为黄色纤维弹性纤维较细，直径0.2-1.0um，有分支，不成束但可交织成网它富有弹性，容易拉长，但不能拉到超过它的极限，外力除去后又恢复原状2、弹性纤维染色的临床应用1）用于区别正常的动脉和静脉以及观察动脉有病变时血管壁各层的情况，如动脉粥样硬化时的各类变化2）用于区别观察各种疾病对弹性纤维的影响及变化，如原发性或继发性高血压可见主动脉弹力纤维增生，老年弹力纤维增多症心内膜弹力纤维增生症常都可见到弹力纤维断裂，梅毒性主动脉炎和皮肤的环状肉芽肿，动脉粥样硬化均可见到裂解，崩解的弹力纤维3）用于弹力纤维性假黄瘤的诊断该病镜下见真皮中下部结缔组织变性，呈团块状或条索状，弱嗜碱性用弹力纤维染色法可以鉴别3、弹性纤维的染色方法 ：维格特氏雷锁辛品红法 、Gomori‘s醛品红法 、地衣红技术、费尔霍夫氏酒精苏木素技术。

二、Masson染色 Masson染色,用于显示组织中纤维的染色方法之一一般的Masson染色用的是三色法，苯胺蓝染液使胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色(如光绿液染色为绿色)，Masson 丽春红酸性复红液使胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，Regaud 氏苏木精染液使细胞胞核黑蓝色三、网状纤维染色1、网状纤维在组织化学上的反应、网状纤维在组织化学上的反应 网状纤维的主要成分是网硬蛋白，在组织化学上，网状纤维和胶原纤维是容易区别的网状纤维是分支纤细的纤维Van Gieson 氏染色不显色或微红色PAS反应呈现红紫色，银浸染为黑色胶原纤维用Van Gieson氏染色为红色，PAS反应呈微粉红色银浸染为黄色或棕黄色2、临床应用临床应用1）可用于区别癌和肉瘤的诊断例如：网织细胞肉瘤和转移于淋巴结内的未分化癌，这两者在HE的染色切片都较难区别，前者可产生网状纤维，后者不产生网状纤维鼻咽部活柱，应将网染作为常规，给予使用，可增加诊断的准确性2）可用于区别血管内皮瘤（肉瘤）和血管外皮瘤（肉瘤），它的瘤细胞在网状纤维膜内，而血管外皮瘤则在网状纤维膜外，血管内皮肉瘤的瘤细胞呈泡巢状，周围多被网状纤维包绕；而血管外皮肉瘤的瘤细胞可见较多的网状纤维。

3）可用于神经系统方面肿瘤的区别如：交感神经母细胞，脑的髓母细胞瘤，这些肿瘤的形态有时象肉瘤，但银染时，神经系统的网染为阴性，不过脑的原发性肉瘤有较多的网状纤维4）可用于观察癌组织的发生发展过程如：原位癌，可见有完整的基底膜，而浸润性癌则可见到被破坏的基底膜5）可用于区别淋巴系统方面的肿瘤如：淋巴肉瘤和网织细胞肉瘤，前者瘤细胞间的网状纤维比正常稍减少，后者则比正常时增多6）可用于急性骨髓纤维化的鉴别诊断，该病的网状纤维增多，纤维可以是致密和融合性的胶原纤维染色通常呈阴性，尽管偶尔有的病例可能显示胶原纤维化四、Van Gieson染色1、结果：胶原纤维染成鲜红色；肌纤维染成黄色；红细胞染成黄色；细胞核染成蓝黑或灰色2、临床应用：胶原纤维发生病变如坏死或透明变性时，它与淀粉样物在HE染色时被染为粉红色，不好区别应用V.G染色法，能将胶原纤维染为粉红色，而淀粉样物将被染为黄色返回敏感性加强型原位杂交（AP） 原位杂交(ISH)是一种可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA的技术，此方法原理是由DNA或RNA的序列与互补的标记单链DNA/RNA探针结合形成标记的双链杂交分子，本技术可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性，定量及定位分析。

在细胞分化调节、基因定位、肿瘤遗传学、分子病理学、病毒学等领域得到广泛应用敏感性加强型原位杂交（AP）仅适应于地高辛高效标记的寡核苷酸探针一、培养细胞和冰冻切片1、培养好的细胞用0.1MPBS洗2min ×3次2、培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：4%多聚甲醛，室温固定20-30min蒸馏水洗，干燥后-20 ℃ 保存3、暴露mRNA核酸片段 胃蛋白酶37 ℃ 消化5-120s， 0.5M TBS洗涤5min ×3次，蒸馏水洗涤1次4、预杂交5、杂交6、杂交后洗涤7、滴加封闭液37 ℃ 30min8、滴加生物素化鼠抗地高辛 37 ℃ 60min9、0.5M TBS洗涤5min ×4次10、滴加SABC-AP 37 ℃ 20min 0.5M TBS洗涤5min ×4次11、BCIP/NBT显色，核固红复染13、风干，水溶性封片剂封片二、石蜡切片1、常规脱蜡至水2、3%过氧化氢室温处理10min，蒸馏水洗5min ×2次.3、暴露暴露mRNA核酸片段 胃蛋白酶37 ℃ 消化10-30min， 0.5M TBS洗涤5min ×3次，蒸馏水洗涤1次4、其余步骤和冰冻切片4-13步相同三、结果观察 阳性细胞的胞浆着色呈深蓝色或蓝紫色，细胞核着色呈红色（图片）四、注意事项 1、石蜡切片水合时所用的不同浓度酒精用0.1%DEPC水配制。

2、缓冲液配制时要用灭菌水来配 3、实验过程中所用的3%柠檬酸需现配现用 4、在冰冻切片原位杂交实验中最重要的组织及细胞的及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC水处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用 5、石蜡切片脱蜡时要用新的二甲苯浸泡，不能要以前浸泡过切片的二甲苯脱蜡返回 microRNA原位杂交图片原位杂交图片返回荧光原位杂交（FISH） 荧光原位杂交技术(florescence in situ hybridization，FISH)是一种利用荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术它将荧光信号的高灵敏度、安全性及直观性和原位杂交的高特异性结合起来，通过荧光标记的核酸探针与待测样本核酸进行原位杂交在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞和组织样本进行检测和诊断，为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据•直接法是用已知碱基序列的特异DNA片段作为探针，并标记上不同荧光素(通常选用绿色、红色、橙色)，在组织切片、间期细胞及染色体标本上与靶核酸进行DNA-DNA原位杂交因所形成的杂交体带有荧光素。

故可在荧光显微镜下直接观察 •FISH实验操作与用非荧光标记探针的原位杂交基本相似在组织准备方面，以新鲜组织、冷冻组织样本、细胞涂片、培养细胞爬片及中期染色体等材料进行FISH的结果优于石蜡包埋组织样本的杂交效果由于FISH是DNA-DNA原位杂交，故在杂交前的变性处理颇为重要荧光原位杂交过程包括以下步骤：标本的固定和预处理；探针变性；靶组织DNA变性；杂交；镜检与结果分析标本的固定：4%多聚甲醛或者丙酮预处理：内源性DNA、RNA去除、蛋白酶消化靶组织或者探针变性：不论探针或靶组织，只要是双链（DNA或cDNA）时，杂交前均需做变性处理，即将双链变成单链结构有时候可以对玻片进行复染，一般用的复染液有DAPI•FISH的优点：•1.操作简便，探针标记后稳定，一次标记后可使用二年•2.方法敏感，能迅速得到结果•3.在同一标本上，可同时用几种不同探针，使用几种颜色的荧光•4. FISH的应用领域 广泛，有基因定位与基因制图 、基因诊断 、间期细胞遗传学 、肿瘤细胞遗传学 、基因定位 、病毒基因插入基因组部分的检测 、基因的扩增与缺失 等。