单抗的制备、纯化和鉴定.doc

单抗的制备、纯化和鉴定单抗的制备、纯化和鉴定一、 实验目的:单克隆抗体制备是细胞免疫学的-•个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫 动物和抗体效价检测等各个方而内容了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法二、 实验原理：骨髓瘤细胞在体外培养能人量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴 细胞能产牛特界性抗体，但在体外不能无限增殖将免疫脾细胞-与骨髓瘤细胞融合后形成 的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，乂 具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力经在IIAT培养基［含有次黄喋吟(II)、如基 喋吟(A)和胸腺喘碇核苜(T)］中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活 而死亡；未融介的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基小的氨基蝶吟阻断，又因缺乏 次黄瞟吟-鸟瞟吟-磷酸核糖转移酶(HGPRT),不能利用培养基中的次黄噪吟完成DNA的 合成过程而死亡只有融介的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嚓吟-鸟嚓吟-磷酸核糖 转移酶，凶此能在HAT培养基中存活和增殖经过克隆选择，对筛选出能产生特升性单克 隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。

三、 试剂与器材：细胞培养板、解剖器械、平血、酶标仪、加样器、细胞计数板、C02培养箱、倒置显微 镜等四、 操作方法：1 抗原制备;•般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原A.可溶性抗原(蛋白质)以lmg/ml〜5mg/ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分 多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml〜0. 6ml,间隔3〜5周再同样注射一次，1 0天后，断 尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验一个月后可以经静脉(尾静脉) 给予无佐剂抗原0. 2ml~0. 4ml, 3 ~ 4天后，杀死小鼠取脾做融合用B.颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间例如 用羊红血球免疫小门鼠，以1 %浓度每只皮下注射0 .2nd,每周2次，共免疫5〜8 次，取脾前3天，再免疫一次即可有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受 的程度更好2、免疫动物;L!前应用最广的是小门鼠和大白鼠，尤以小门鼠为好就品系而言以Balb/c小门鼠应 用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来Balb/c系小白鼠必 须用纯系的，雌雄均可，以旷12周龄为宜大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。

现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小 鼠一人鼠，小鼠一人以及人一人杂交瘤技术免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键Z-0正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1. OX 107~5. 0X107种不同的抗体因此一只正常的小门鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合， 只能有千万分Z—的机会获得某一种特定抗体所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必 须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞人量增加B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很人影响有人认为处在转化时期的 B淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后厂8天，虽然是抗体产生的高峰时期，但形成有 活力的杂交瘤细胞的可能反而减少故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融 合3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；脾细胞制备(1) 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠，拉颈或川C02处死小门鼠2) 将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾3) 把脾放入5ml含有2. 5%FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球4) 用锡了轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。

5) 直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中6) 以2. 5%FCS—1640充满离心管,并以400g离心7min〜lOmin (与此同时应开始制 备骨髓细胞)7) 把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮8) 重复⑹、⑺步骤9) 计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检杳，活细胞数应高于80%为合格骨髓瘤细胞制备骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋门，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所 分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的來源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两 者的组织相容性抗原一致；②骨髄瘤细胞必须是静息状态，不产生Y球蛋白或不分泌到 细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度，瑕好106个细胞/ml；④生长速度 快，繁殖时间短目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有:S194/5XX0 • BU • 1；②SP2 / 0—Agl4 （简称 SP2）；③P3/X63-Ag8. 653 （X63-Ag8. 653）（简称 653）：④FO以653最为常用，它是由矿物油4一甲基一15烷(Pristane,降植烷)诱发出來的一种 浆细胞瘤(Minerol 0i 1 plasmacy toma, MOPC)并经过培育形成一株8-氮鸟卩票吟有抵抗 力的亚系。

骨髓瘤细胞-•般由有关单位直接引入，保存于-195C液氮罐中，试验时复苏、增殖、传 代即可由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理为了防止出 现返祖现彖，在融合前，可将培养棊内加入15ng/ml 8—氮鸟嚟吟取约IX 107〜 6X107对数生长期(即培养15h〜20h)的骨髓瘤细胞，在室温离心(400g) lOmin,沉淀 以2. 5%FCS—1640液再悬浮并计数饲养细胞在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细 胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称Z为饲养细胞(Feeder cell) o在细胞融合和单克 隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过 程中必须使用饲养细胞许多种类的动物细胞都叮以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺 细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞应用腹 腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞 碎片，为融合细胞的4：长造成良好的坏境腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠 也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小门鼠等。

1) 拉颈处死小鼠2) 70%酒精浸泡消毒lOmino(3) 用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔4) 丿I］注射器将伽1 11.6%蔗糖溶液注入腹腔，川手指轻揉lmin仍用该注射器冋抽腹 腔液体，加入离心管5) 1 000r / min 离心 10mino(6) 取上清，以IIAT选择培养液将细胞制成悬液台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升 含40万个活细胞7）以lml吸管将细胞种入微量培养II1L,每孔0. 05ml,含2力个细胞，放入C02培养 箱培养，即可供细胞融合和克隆化Z用如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少， 则可以在细胞换液时再加入一些4、细胞融合；小鼠骨髓瘤可以在体外培养液中生存并大量繁殖经过用某种抗原免疫的小鼠及淋巴细 胞能分泌某种抗体，但小鼠的B淋巴细胞在一般培养某中不易存活如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗体的B淋巴细胞在融合因子（聚乙二醇，PEG）作 川下产生融合，则融合的细胞既具河肿瘤细胞易分裂增殖的特性，又具有B淋巴细胞分泌 特异性抗体的能力，在MT选择培养基中可以选择得到杂交细胞这种融介的被称为淋巴 细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中人量繁殖生长，从培养液上清中对以收集到人量某 B淋巴细胞产物——单克隆抗体。

1）、取末次免疫后的第3天小鼠脾细胞悬液,将108小鼠脾细胞与1 -5X107Sp2/0 小鼠骨髓瘤细胞混合于50毫升刻度离心管中，经1000转/分离心7分钟；（2）、弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离 心管置37C水中进行水浴（一小烧杯中），准备融合；3） 、将37C水浴中保温的50%PEGl. 0毫升（实际应用0.7毫升）用滴管缓慢滴入离心 管中，在60秒钟内滴完，在37C水浴中边滴边摇边离心管，使细胞保存在混匀状态；4） 、加完PEG后，将细胞悬液放在37C水浴中静置90秒钟，立即在2—4分钟内加入 15毫升无血清的RPMT-1640培养基（37C）,开始要一滴一滴地加，由于稀释使PEG停止 作用注意尽可能不搅动细胞；5） 、再经100转/分离心10分钟弃去上清液，加25毫升HAT培养液，轻轻混匀，将 泯悬液分装已有巨噬细胞的两个24孔培养板中，每孔0. 5毫升；6） 、将培养板放在水蒸汽饱和C02孵箱中,37C孵育CO2含量为5%；7） 、每2—3天换一次HAT培养液，连续2周观察杂交瘤细胞是否出现2周后使用HT 培养基5、杂交瘤细胞的选择培养；一般在融合24小时后，加IIAT选择培养液。

IIT和IIAT均有商品化试剂50X贮存，川时 lml加入50ml 20%小牛血清完全培养液中因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200P1/孔所以在加选择培养液时 应加3倍量的HAT我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2/3进行选择，可得到满 意的筛选结果50XIIATII: 5X10-3MA: 2X10-5MT: 8X10-4M一般选择IIAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一 般培养液6、 杂交瘤细胞的筛选筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针対免疫原的特异 性抗体一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所 需要的杂交瘤细胞系检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快 速、简便、特异、放感的方法为原则常用的方法有：1. ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测2. RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测3. FACS（荧光激活细胞分类仪）用于检查细胞表而抗原的McAb检测4. 1FA用于细胞和病毒McAb的检测上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。

可靠的筛选方 法必须在融合前建立，避免曲于方法不当贻误整个筛选时机7、 杂交瘤细胞的克隆化克降化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化W r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保 证一个孔内只有一个克隆在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，对能包括抗体 分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细 胞耍想将这些细胞彼此分开，就需耍克隆化克隆化的原则是，対于检测抗体阳性的杂 交克隆应尽早进行克降化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体 非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竟争的结果会使抗体分泌的细 胞丢失即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染 色体丢失，从而丧失产生抗体的能力克隆化方案川克隆化的方法很多，而最常川就是冇限稀释和软琼脂平板法1. 有限稀释法的程序%1 制备饲养细胞悬液（同融介前准备）%1 阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1〜5X103 / ml%1 取130个细胞放入6. 5ml含饲养细胞完全培养液,即20个细胞/ml, 100ul/孔加 A、B、C三排为每孔2个细胞余下2.9n）l细胞悬液补加2. 9ml含饲养细胞的完全培养液, 细胞数为1。