细胞免疫检测技术课件.ppt

第一节第一节 E花环试验花环试验Erythrocyte Rosette Test 第二十五章第二十五章 细胞免疫检测技术细胞免疫检测技术细胞免疫检测技术豚鼠豚鼠T T细胞表面有细胞表面有E E受体受体=CD2.=CD2.家兔红细胞（家兔红细胞（RBCRBC）表面有）表面有CD2CD2的配体，即的配体，即CD58.CD58.将淋巴细胞与将淋巴细胞与RBCRBC按一定比例混合后，在一定条件下按一定比例混合后，在一定条件下就形成一个就形成一个T T细胞结合多个细胞结合多个SRBCSRBC的玫瑰花一样的花的玫瑰花一样的花环，即环，即E-E-花环花环(erythrocyte rosette)(erythrocyte rosette)，取样涂片，取样涂片染色、镜检计数可得花环形成率染色、镜检计数可得花环形成率E-E-花环实验原理花环实验原理CD2 and CD58 CD2 and CD58 • • s smilarmilar structure structure • • ligandligand of CD2---CD58 of CD2---CD58 ligandligand of CD58---CD2 of CD58---CD2• CD2 also called SRBC-R(• CD2 also called SRBC-R(绵羊红细胞受体绵羊红细胞受体绵羊红细胞受体绵羊红细胞受体) )细胞免疫检测技术 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。

淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定 第二节 淋巴细胞的功能检测细胞免疫检测技术淋巴细胞淋巴细胞ØT T细胞（负责细胞免疫功能）细胞（负责细胞免疫功能）ØB B细胞（执行体液免疫功能）细胞（执行体液免疫功能）ØNKNK和和K K细胞（非特异性免疫作用）细胞（非特异性免疫作用） 细胞免疫检测技术一、T细胞功能的检测ØT T细胞增殖试验细胞增殖试验ØT T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定ØT T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验Ø体内试验体内试验细胞免疫检测技术（一）（一）T T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验1. 1. 原理：原理：淋巴细胞淋巴细胞DNADNA合成合成分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染色质疏松细胞免疫检测技术 未转化和转化淋巴细胞的形态特征未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞淋巴母细胞 过渡型过渡型细胞大小细胞大小( (直径直径μm)μm)1212～～20201212～～16166 6～～8 8核大小、染色质核大小、染色质增大、疏松增大、疏松增大、疏松增大、疏松不增大、密集不增大、密集核仁核仁清晰、清晰、1 1～～4 4个个有或无有或无无无有丝分裂有丝分裂有或无有或无无无无无胞质、着色胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色极少、天青色浆内空泡浆内空泡有或无有或无有或无有或无无无伪足伪足有或无有或无有或无有或无无无细胞免疫检测技术2. 2. 淋巴细胞转化的刺激物淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：非特异性刺激物： PHA ------T PHA ------T细胞细胞 ConA -------T ConA -------T细胞细胞 PWM -------T PWM -------T、、 B B细胞细胞 LPS -------B LPS -------B细胞细胞特异性刺激物：特异性刺激物： 异种抗原异种抗原 同种组织抗原同种组织抗原 细胞免疫检测技术3. 3. 检测方法检测方法 形形态态法法：：刺刺激激物物 淋淋巴巴细细胞胞（（4-64-6天天）） 母母细细胞胞化化 同位素法：同位素法：PHA PHA 淋巴细胞（淋巴细胞（54h54h）） DNA DNA合成期合成期 + + 3 3HTdRHTdR掺入掺入 收集细胞收集细胞   检测检测ββ射线射线 测定细胞内的测定细胞内的3H3H－－TdRTdR细胞免疫检测技术方法学评价：方法学评价：Ø优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。

适于基层实验室应用Ø缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差响，重复性和准确性较差 （（1 1）形态学检查法）形态学检查法细胞免疫检测技术（（2 2））3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法Ø优点：优点：3H-TdR3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，掺入法敏感性高，客观性强，重复性好重复性好Ø缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题性核素污染问题细胞免疫检测技术( (二二) T) T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定 体外培养的体外培养的T T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后细胞经各种丝裂原或抗原刺激后, ,分泌各种细胞因子分泌各种细胞因子, ,可借助免疫学、细胞生物学及分可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映或基因表达水平，以反映T T细胞功能细胞功能 细胞免疫检测技术（三）T细胞介导的细胞毒试验1.1.原理：原理：靶细胞抗原靶细胞抗原T T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTLCTL靶细胞靶细胞细胞免疫检测技术Ø形态学方法：淋巴细胞形态学方法：淋巴细胞+ +肿瘤细胞肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞计数残留肿瘤细胞Ø同位素法同位素法 ：淋巴细胞（：淋巴细胞（CTLCTL））+ +含含51Cr 51Cr 的肿瘤细胞的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏肿瘤细胞破坏 51Cr 51Cr 释放释放 测定测定γγ射线射线2.方法意义：意义： 肿瘤患者肿瘤患者CTLCTL杀伤肿瘤细胞的能力杀伤肿瘤细胞的能力 细胞免疫检测技术( (四四) ) 体内试验体内试验Ø特异性抗原皮肤试验特异性抗原皮肤试验ØPHAPHA皮肤试验皮肤试验 细胞免疫检测技术二、B细胞功能检测ØB B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验Ø溶血空斑试验溶血空斑试验ØB B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测Ø体内试验体内试验细胞免疫检测技术( (一一)B)B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验抗抗IgMIgM细菌脂多糖细菌脂多糖SACSAC的的SPASPAB B细胞增殖细胞增殖形态学形态学3 3H H－－TdRTdR掺入法掺入法细胞免疫检测技术( (二二) ) 溶血空斑试验溶血空斑试验1. 1. 原理：原理：细胞免疫检测技术( (三三) )　　 B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测 —— ——酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法1.原理：原理：细胞免疫检测技术2．应用与方法学评价：Ø该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。

体分泌量Ø优点：优点：稳定、特异、抗原用量少；稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞测组织切片中分泌抗体的单个细胞细胞免疫检测技术( (四四) )　体内试验　体内试验Ø体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等Ø将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后疫后1 1周、周、2 2周、周、3 3周分别采血，分离血清，测定受检周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B B细胞细胞的功能细胞免疫检测技术染色计数染色计数离心取上清离心取上清测测LDHLDH或或AKPAKP离心取沉淀离心取沉淀测活细胞荧光测活细胞荧光测发光强度测发光强度测测CPMCPM值值Ø形态法形态法Ø酶释法酶释法Ø荧光法荧光法Ø同位素法同位素法Ø化学发光法化学发光法三、NK细胞活性测定靶靶细细胞胞溶溶解解常用靶细胞常用靶细胞: : K562细胞株细胞免疫检测技术第三节 吞噬细胞功能检测技术 吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。

作用三个阶段，据此建立相应的检测方法 一、中性粒细胞功能检测技术一、中性粒细胞功能检测技术 二、巨噬细胞功能检测技术二、巨噬细胞功能检测技术细胞免疫检测技术一、中性粒细胞功能的检测Ø 细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测Ø 吞噬和杀菌功能的检测吞噬和杀菌功能的检测细胞免疫检测技术( (一一) ) 细胞运动功能细胞运动功能————趋化功能检测趋化功能检测琼脂糖平板法琼脂糖平板法 滤膜渗透法（滤膜渗透法（Boyden 小室法）小室法）细胞免疫检测技术( (二二) )吞噬和杀菌功能测定吞噬和杀菌功能测定 1 1．显微镜检查法：．显微镜检查法：细胞免疫检测技术2. 溶菌法3 3．．NBTNBT还原试验还原试验 细胞免疫检测技术二、巨噬细胞功能检测( (一一) )炭粒廓清试验炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%90%炭粒，炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除脾巨噬细胞约吞噬清除10%10%炭粒据此给小鼠定量炭粒据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁静脉注射印度墨汁( (炭粒悬液炭粒悬液) )，间隔一定时间反，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。

炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能细胞免疫检测技术( (二二) )吞噬功能检测吞噬功能检测 巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞功能，常用鸡红细胞(CRBC)(CRBC)、白色念珠菌、酵母、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞 细胞免疫检测技术( (三三) )巨噬细胞溶酶体酶的测定巨噬细胞溶酶体酶的测定1 1．酸性磷酸酶的测定．酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法硝酸铅法 偶氮法偶氮法2 2．非特异性酯酶的测定．非特异性酯酶的测定 常用常用α-α-萘醋酸法萘醋酸法( (四四) ) 细胞毒作用测定细胞毒作用测定 用用IFN-γIFN-γ激活小鼠巨噬细胞，观察其对激活小鼠巨噬细胞，观察其对125I-125I-UdRUdR标记的标记的DBA/2DBA/2小鼠肥大细胞瘤小鼠肥大细胞瘤P815P815的杀伤活性的杀伤活性细胞免疫检测技术( (五五) ) 巨噬细胞促凝血活性测定巨噬细胞促凝血活性测定 激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经37℃37℃预温的正常兔血浆和预温的正常兔血浆和CaCl2CaCl2混合液，加入经混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置37℃37℃，即时，即时记录血浆凝固时间。

记录血浆凝固时间细胞免疫检测技术反映机体免疫功能状态反映机体免疫功能状态肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施第四节第四节 免疫细胞功能检测的临床应用免疫细胞功能检测的临床应用细胞免疫检测技术。