小鼠基因组DNA抽提原理、仪器试剂和操作步骤.docx

小鼠基因组 DNA 抽提原理、仪器试剂和操作步骤一、原理与意义先用细胞裂解液对已制备好的组织匀浆充分裂解，然后用蛋白酶去除其中的蛋 白，再用氯仿一次抽提（无需用酚抽提）、预备液沉淀、RNase去除RNA、乙醇 再沉淀即可得到完整DNA该方法适用于从人或动物的各种组织、血液、培养细 胞、G+/G-细菌中快速抽提基因组DNA抽提出来的DNA能用于几乎所有的分子 生物学实验，如DNA梯度分析、PCR、限制性内切酶反应、克隆、Southern Blot 分析等二、 试剂及其配制抽提试剂盒购于上海生工公司，内含以下试剂：1、 TE 缓冲液：PH8.0,由 10 mM Tris HCl 和 1 mM EDTA 配成2、 RNase A（3 mg）：使用前加入300 ul无菌双蒸水，煮沸10 min后使其自然 冷却后使用，-20 °C冻存3、 Proteinase K （12 mg）：使用前加入600 ul无菌水，分装成小份，-20 C冻存4、 Cell Lysis Solution 与 Precipitation Solution：溶液出现絮状沉淀 50 C加热溶 解后使用5、 1.2 mol/L NaCl。

冰冷乙醇和氯仿自备三、 实验器材水浴锅、普通冰箱、1.5/2 ml离心管、移液器及枪头、紫外分光计、离心管架、 剪刀、镊子、滤纸等四、 操作步骤1、 组织匀浆制备：取30 mg左右新鲜组织，加600 ul TE缓冲液，手工匀浆数 次2、 细胞裂解：吸取300 ul匀浆加600 ul Cell Lysis Solution,混匀3、 消化蛋白：再加入9 ul Proteinase K （可适当增加）混匀，置于55 C水浴30 min以上（可达2.5 h），其间上下混匀几次4、 氯仿抽提：加入600 ul氯仿（用户自备），轻柔上下混匀，不能太剧烈，以保证DNA的完整性5、 沉淀：在台式离心机上，10000转/分，室温离心2 min此时应分成三层， 基因组 DNA 在上层中，如未能分层，表明样品与氯仿未混匀（可通过延长离心 时间或增加离心速度获得上清）取500 ul上清液，置于无菌1.5 ml离心管中， 加入500 ul Precipitation Solution,混匀多次至出现絮状物，室温静置2 min10000 转/分，离心 2 min6、 去除RNA:弃除上清，注意不要倒掉沉淀，立即加入100 ul 1.2 mol/L NaCI， 轻轻振荡直至DNA样品完全溶解，加入3 ul RNase A，置于37 °C 10 min，以去 除 RNA。

7、 沉淀DNA：加入300 ul冰冷乙醇（终浓度为75%，沉淀效果最佳），-20 C 放置10 min10, 000转/分，离心2 min倒掉乙醇，倒置室温干燥10~15 min 若DNA量多，可再重复沉淀一次DNA用TE缓冲液或100 ul三蒸水溶解五、注意事项1、 应避免多次冻融样品，因为每次冻融都大大降低完整DNA的产率2、 加氯仿充分混匀，若离心后上清不到500 ul，可适当延长离心时间或增加离 心速度3、 吸取DNA上清时，可用剪刀稍剪枪头尖部，以防止虹吸现象4、 操作步骤中许多数值可进行成比例改变，如上清与预备液按 1： 1，氯化钠 与无水乙醇按1： 3等5、 转录活性很高的组织或细菌中通常含有大量的RNA，他们可能与DNA 一起 被分离出来RNA的存在并不影响PCR反应如果需要制备RNA- free的基因组 DNA可在第6步加入200 ul的RNase A，37 C保温10 min即可6、 用分光光度计测量DNA含量按1 OD260=50 mg基因组DNA；进行0.7%琼脂 糖凝胶电泳判定DNA的完整性，也可以判定样品中是否有RNA本试剂盒可抽 提长抵达50kb以上的DNA。

一般在DNA样品，0D260/0D280比值大于1.8，可 能存在RNA； OD260/OD280比值小于1.6,可能存在蛋白质或酚但RNA样品中 OD260/OD280比值小于2可能存在蛋白质或酚，均需要进一步纯化7、 通常50ul体系PCR反应中用1~5 ul DNA。