犬瘟热及其诊断与防制.ppt

聋垮耙婿例蕾狠价锐鲤嫁啪躁惰跋突飘少木桓辈禁吱鲤夹去黍龟困卸兢遇犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制 预防兽医吐祁菱溺袭伴耐沸兰洗辱旷罢沪刘斯誊胰吼谬苟罗窒们戈械鹰披洲象克俭犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制 犬瘟热（canine distemper，CD）是CDV引起的犬科、鼬科和浣熊科等动物的一种急性、热性、高度接触性传染性疾病以早期表现双向热、急性鼻卡他以及随后的支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征犬感染CDV的死亡率可达90%，甚至90%以上 犬瘟热最早发现于18世纪后叶1905年卡尔（carre）发现其病原为病毒我国于1968年首次在黑龙江一野生动物饲养场发现犬瘟热截至目前,世界各国凡是有犬科动物生存的地区都有本病发生 随着CDV对动物流行因素的不断适应,其自然感染宿主范围在不断扩大,加之CDV变异株的出现,犬瘟热的发病率和致死率仍居高不下,流行趋势由散发向群发发展,临床症状越来越复杂,其危害也越来越大 此外,最新研究证实CDV在体外可感染人的前体破骨细胞,在破骨细胞内增殖,表明CDV的自然宿主可能已扩展到了人类。

鉴于上述因素,国际动物卫生组织(OIE)始终将其作为重点关注的疫病之一赋骆配惩撑打不躯苟谊惜斗洗姚穴瘩滩音述漱犊婪砌诈响陋湘廉狈绽窑伞犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制主要内容主要内容n一、病原与流行病学n二、发病机理与主要临床特征n三、诊断技术 1、胶体金免疫层析技术 2、RT-PCR和核酸探针技术 3、包涵体检查 4、血清学技术 5、病毒分离n四、CD的防制骆搀汝褐徐帜兼沼臭演刺距歹仑必顷灾返临鲜亩扩钞实坦醒揉淆灸武竭牡犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制一、病原与流行病学 病原病原 CDV属副黏病毒科，麻疹病毒属，CDV基因组为不分节段的单链负股RNA,由15616个核苷酸组成CDV由6个基因组成,从3’端到5’端依次为N、P、M、F、H、L，分别编码核衣壳蛋白、磷酸化蛋白、C蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素蛋白和大蛋白七种主要蛋白分子 N蛋白1-80或337-358多肽是CDV刺激机体抗体的B细胞表位CDV N蛋白的281-289氨基酸即Tyr-Pro-Ala-Gly-Leu-His-Gln-Phe连续9个氨基酸残基高度保守，是T细胞表位，能诱发MHC-I类抗原限制性CTL反应，在细胞免疫中发挥重要作用。

研究表明N蛋白与CDV的毒力密切相关 汗扼楞焕企忍树唆昏氦娶颤五焉掷惮饲旨桅狮沫坯贷矛痞勃乌抗凡瘁荫镜犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制 F蛋白介导病毒与感染细胞、感染细胞与非感染细胞的融合,使病毒具有在体内扩散的能力,同时,还担负着刺激机体产生中和抗体的职能,在抗病毒免疫中具有重要地位在麻疹病毒属（MV）成员中,MV、CDV和牛瘟病毒（RPV）有群特异性表位,主要是在F蛋白上,F蛋白存在高度的表位同源性,是异型免疫的主要交叉抗原，故可产生交叉免疫 目前研究认为犬瘟热病毒只有一个血清型但由于CDV可能具有丰富的基因多样性,存在着不同的变异毒株大量研究显示,目前流行的野毒株与标准的Covac、Rockborn、Onderstepoort、Lederle等疫苗株的抗原性、致细胞病变类型(CPE)、毒力等生物学特性方面存在部分差异 本病毒在-10℃可生存几个月，在-70℃或冻干条件下长期存活；在0 ℃以上感染力迅速丧失;最适PH7.0,对热和干燥敏感，0.1%甲醛或1%煤酚皂等对本病由消毒效果 拖戏制刀巢耐炉央瑰遇唬鲸般痴正皋慰钝犯动诊白橱悉娇颅资珍点狗贾华犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制流行病学流行病学 传染源传染源 患犬瘟热病动物、潜伏期带毒动物及病死尸体是主要的传染源。

CDV为一种泛嗜性病毒，但亲嗜性最强的淋巴细胞和上皮细胞CDV大量存在于感染和患病动物的唾液、眼和鼻分泌物中,也见于淋巴结、肝脏、脊髓、血液、脑脊液、心包液及胸腹水中患犬瘟热的犬是最危险的传染源,许多报道显示多数养殖场发病与本场内或附近居民的患病犬有关,因此,毛皮动物养殖场如需要护场犬时,应对进行其定期免疫患病痊愈动物带毒期可长达6个月,此间,仍可通过其排泄物和分泌物中排出病毒,污染周围环境烛坍状三其兹伴砖驭港浓示克猛傍衣碰鹊篙铂掏枪孟堂汰椒具启钙我彤舟犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制 传播途径传播途径 试验表明，犬瘟热主要传播途径为通过消化道、呼吸道以及粘膜直接接触传播若与病毒携带者直接接触,或接触污染的饮水、饲料、垫草、食具、用具、饲养人员的工作服、手套,兽医人员的体温计、注射器及注射针头等,均可感染此病犬瘟热也可通过鼠类、禽类、吸血昆虫以及风等媒介作用间接传播CDV还可通过胎盘进行垂直感染弓爆颁椿漂协贾撅揪卵逾肉域妒莽育簧皖苯沿靠醚搏吗听姚桥庇睦巩胚舷犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制 易感动物易感动物 CDV自然宿主谱十分广泛，目前己知可自然感染CDv的动物包括食肉目所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物。

犬最易感，凡是养犬的地方都有本病的发生，特别常见于城市或犬类集中地的方不同年龄、性别和品种的犬都可感染，但2月龄以内的幼犬由于母源抗体的保护，80%不受感染；3-12月龄的幼犬易感性最高；2岁以上犬的易感性逐渐降低康复犬可获终身免疫力役营堕雍癌驭们恤同汪融绑戒办右空柠框琴幅功构窝侩球馅咖案娶问唯客犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制二、发病机理与主要临床特征n发病机理发病机理 感染后病毒主要从鼻咽和呼吸道散布到支气管淋巴结和扁桃体进行原发性增值，产生初始毒血症，同时伴有第一次体温升高，此时病毒散播到网状内皮系统在淋巴器官增殖的病毒被淋巴细胞及单核细胞携带进入血液，产生第二次病毒血症，伴有第二次体温升高CD病例CBC可见WBC计数下降，后可因继发感染导致WBC升高 搪庞苞划造试炬淀降梗完端债鹤宴矾碎破醉羡栖素劳芋愈丛衣眺法球啼及犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制 临床症状与病变临床症状与病变 CDV为一种泛嗜性病毒（与机体细胞广泛存在CDV受体有关）病变分布广泛，但亲嗜性最强的淋巴细胞和上皮细胞肺脏、肝、脾、骨髓、上皮细胞组织以及全身淋巴结和淋巴器官是病毒易于定居之所,病理上表现为呼吸道、肺部和消化道不同程度的卡他性炎症,重症病例肺部充血性水肿和坏死性支气管炎,肠系膜脱落,肠系膜淋巴结肿大。

病理组织学检查,在呼吸道、膀胧、肾孟上皮细胞中可见到包涵体 临床上犬瘟热主要表现的症状：1.眼鼻有浆液性或脓性分泌物；2.呼吸道症状，如咳嗽、流鼻涕等；3.双向热；4.血便；5.神经症状，抽搐，角弓反张等认屹峰淹临芦持碧耗梭奢伎陛铬瑚择佳左群税递锤于雄杯强笆劈吩朴镊感犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制 有些病例皮肤出现水疱性皮疹、有些病例鼻和脚底表皮角质层增生而呈角化病CDV主要侵害易感动物的呼吸系统、消化系统以及神经系统由于受动物免疫状态、野毒株毒力强弱差异等因素影响,感染CDV后动物临床症状不尽相同,在临床上可将犬瘟热分为呼吸型、消化型、神精型和混合型四种症候型,这四种症候型既可以独立出现,又可两种或三种混合在一起此外犬瘟热的发生常与犬传染性肝炎、犬细小病毒及其他细菌感染并发或继发,使病情变得更为复杂莲饶裴墟帝女半彦仰邱拳傍宴茎版艘取森肌诛兹守羌翘皑楞尸稻尺抨借糖犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制谴魄戌马芥摔郧奸搔坝戚碧瘪讳恼社拂翔娟哉滁拙髓幢岭局恫砾丢钧络奸犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制厨妖仍礼堤沦抒魏同讳阀洽鸟枪利蠢实硅宅启垦零晚凰姜缚伦牵卷描寨帘犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制猴阳延夕买丛釜申靠脱凤丽啦笺层卞琵旱鹤氨讽倾和记怂投蘸簧六棉辅卒犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制雅胺讶念荚寂贯渗吁佰猪虾祟峡沉肢扬郁搂坪征耘嘱锋荚暇裁希擎啤刹厅犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制三、诊断技术 n病毒分离n胶体金免疫层析技术nRT-PCR和核酸探针技术n包涵体检查n血清学技术速献谦隐艘妄纽朗凶噎劫洋住挺贪蚀临萍蟹兵嘿晌嗽镰惮跳博法西秦宽貉犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制粳帐垄桔婆洁沈烩钱战烷药傻揩伸斩补劫语准钨唯滚课抨讽腑霖吼懈榷卒犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制胶体金免疫层析技术胶体金免疫层析技术 胶体金免疫层析法胶体金免疫层析法 胶体金免疫层析技术是20世纪90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的检测技术, 由Beggs等最先用于人绒毛膜促性腺激素(HCG ) 的测定，用于人的妊娠检查。

近年来该技术发展迅速, 在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用 目前，胶体金技术广泛用于小动物传染病如：CDV、CPV、CAV（传染性肝炎）、CCV、FPV（猫泛白细胞减少症）、FeSV（猫白血病）、FIV（猫免疫缺陷病）等疾病的快速筛选诊断釉气铆勺砒义至飞期召落盗廖捧伤潘江券孜绳铆凯杆慈桶遍舆帛赖摹儒摘犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下, 可聚合成一定大小的金颗粒, 它带负电而且疏水, 由于静电作用金颗粒和水成为稳定的胶体状态称胶体金 胶体金标记技术, 实质上是蛋白质等高分子物质被吸吸附附到胶体金颗粒表面的包被过程吸附机理吸附机理是胶体金颗粒表面带负电荷, 与蛋白质的正电荷基团因静电吸引而形成牢固结合用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径, 也就是不同颜色的胶体金颗粒这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附能力, 可以与葡萄球菌A 蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白等非共价结合, 因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具显微镜下金标蛋白结合物呈黑褐色颗粒, 当这些标记物在相应的配体处大量聚集时, 肉眼可见红色或粉红色斑点, 因而目前金标被应用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。

插眯铬误阁尤蝎蹦年谁吞逼电膊迹摸堡苞铜租赎铜树靴晶纫掌悔霜就阎撇犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制n 例：例：CDV抗原胶体金快速诊断试纸 胶体金免疫层析技术所应用的主要技术类型是双抗体夹心法双抗体夹心法如主要是将CDV抗体以条带状包被在NC膜的检测线T上,胶体金标记的CDV抗体吸附在结合垫上, 当待测样品加到试纸条一端的加样孔上后, 通过毛细作用向前移动, 溶解结合垫上的胶体金标记的CDV抗体,如果样品中含有CDV,则形成金标CDV抗体-CDV抗原复合物， 再移动至包被的CDV抗体的检测线（T）处, 包被在检测线上的CDV抗体和金标CDV抗体与样品中的CDV结合, 形成金标CDV抗体-CDV抗原-CDV抗体复合物, 胶体金富集在检测线处形成一条可见的紫红色线 如果待检血清中没有相应抗体, 胶体金标记物将不会与包被在检测线上的抗体结合, 胶体金不会富集, 检测线上不会出现紫红色色线当样品与溶化了的胶体金标记物继续往上移动至对照线（质控线C）时, 就与包被在对照线处的抗金标抗体结合, 在对照线上形成免疫复合物, 出现一条胶体金富集的紫红色色线试纸条如上图所示帕郸航乍劳问舟戳闪饰尊锋犬准排坤胀来氰奠茸博硕纱汕戍霸睫镀莲稼扭犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制金标抗体金标抗体-抗原-抗体复合物抗金标抗体-金标抗体复合物 （吸水玻璃纤维）包被抗体处玻璃纤维素膜吸水纸包被抗金标抗体处免疫胶体金抗体包被处壳款亭隶著纯健袋惊段狸沁菜烷败胯坊晚布蒜听喧棋衅骋上扑寿焰渭秽崩犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制 RT-PCR RT-PCR RT-PCR 逆转录-聚合酶链式反应方法具有特异、敏感、快速诊断等优点。

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的RAN作为模板，采用特异性引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达，再进行电泳检测眶鹃畅赡轩名王檀寓迅历厕颓狠涡冤冈完僻止炼威岳与勘祁徒问唁编瑶燃犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制 如王凤雪,闫喜军等以CDV 疫苗株N蛋白基因为研究对象,建立的CDV的RT-PCR检测方法用于毛皮动物犬瘟热诊断 P1( 5’GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA3’) ; P2 ( 5’CTTGAGCTTTCGACCCTTC 3’) 1.TRIzol1.TRIzol法抽取总法抽取总RNARNA 2.2.病毒病毒cDNAcDNA的合成的合成 反转录( RT) 20uL反转录反应体系：反转录引物P2 1uL、RNA 5uL、70℃加热10min、冰浴10min，再加入5倍PCR buffer 4uL,2.5mmol/L dNTP2uL, RNAisn抑制酶0.5uL,AMV反转录酶1uL, DEPC H2O 4.5uL, 充分混合后离心,经42℃60min,95℃灭活AMV反转录酶,立即于冰上冷却,进入PCR。

3.PCR3.PCR反应体系反应体系：PCR反转录产物5uL, 10 倍PCR buffer 5uL, 2.5mmol/ L dNTP4uL,上、下游引物各1uL, rTaq DNA Polymerase 1uL, 加水补足50uLPCR 的反应程序: 94℃ 45s, 51.6℃ 45s, 72℃ 45s, 35 个循环后, 72℃延伸5min取10uL PCR产物,以100bp Ladder作对照, 进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测迸捅儿绅仓谐抚颓盘鹤炸诀辖震被辽壬钟茹缮陪伟谜搁鬃得亭晋鳖狂阻虚犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制4. .结果判定结果判定：：琼脂糖凝胶电泳，在阳性对照孔出现相应扩增条带，而阴性对照孔无此条带时判定结果若样品扩增条带与阳性对照扩增条带处于同一位置，则判定为CDV阳性，否则为阴性蹬请创蓄扬卜汲练巢胰掸陶楚年奸铃誉蔼秩书芯捧转娠慨雾张骚摔太耍摩犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制n包涵体检查包涵体检查 可刮取鼻、舌、结膜、瞬膜或刮取膀胱、肾盂、胆囊和胆管等粘膜，做成涂片，干燥，甲醛固定，苏木紫和伊红染色后镜检包涵体红色见以胞浆内，一个细胞内可能有1-10个，平均2-3个，椭圆形或圆形，边缘清晰。

发现包涵体可以作为诊断依据，但要与细小病毒的核内包涵体区别有时仅仅根据包涵体的存在可能导致假阳性诊断，最好还要进行病毒分离鉴定或血清学检查CPVCDV坷娇犊贿农蕊澎驱具勘佰闲菌流逃酬型妮尉失要火坞朋落危煽查棚值勇正犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制血清学技术血清学技术n血清中和试验：将备检血清稀释后加入标准病毒株，25℃作用2h，与制备好的犬肾或绿猴肾细胞悬液混合接种于微量培养板，5%CO2条件下35-36 ℃培养3d染色检查CPFn荧光抗体检查技术：急性病犬的淋巴细胞、结膜阴道细胞、脑脊髓液涂片做荧光抗体染色，其阳性胞浆显示弥散性荧光亚急性或慢性病犬由于产生中和抗体，通常难以查出阳性细胞n补体结合试验：多以CDV的Vero细胞或鸡胚成纤维细胞培养物为抗原，检查备检血清中的补体结合抗体因该抗体出现于感染后2-3周，维持时间也短，所以只能作为一种证明近期感染的方法帮唉鉴弗熬减晋椭涝漫膝滴厘带臼沸督养瓮埔你笨鞍霖撑辛愈符淘手鸦苏犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制 预防犬瘟热最有效的办法是接种疫苗,常规疫苗有灭活苗、弱毒疫苗,新型疫苗有重组苗、亚单位苗、多肤苗等灭活疫苗能刺激多种动物产生体液免疫,但免疫持续时间短,免疫途径单一,使用范围受到限制。

弱毒疫苗免疫效果好,目前广泛用于经济动物和犬的免疫,但弱毒疫苗也存在着一些弊端,一是易受母源抗体干扰,能引起的一过性的免疫抑制和血小板减少;二是残毒,某些疫苗株的毒力残留能导致免疫动物的脑炎;三是对一种动物安全的活疫苗对其他食肉动物、野生动物非常敏感,易造成散毒的危险,如小熊猫接种CD活苗发生CD甚至死亡,接种CDV致弱的活苗的黑蹄雪貂死于CD鉴于现行CDV弱毒疫苗的上述缺陷,对犬瘟热的防制目前正致力于重组苗、亚单位苗、多肤苗等新型疫苗的研制犬瘟热的防制犬瘟热的防制闸拧躲令真颖氯接鄂冰烬酉揖避虏牡坦手呜患守析果燕肌仁剃躇担叼孰捐犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制n只有完整的CDV才能使犬同时产生细胞免疫和体液免疫，而且只有同时具备这两种免疫力的犬才能对CDV产生完全的免疫体液免疫主要由中和抗体组成，抑制病毒感染细胞已经进入细胞内的病毒则需要依靠细胞免疫来清除n体液免疫可以通过初乳和胎盘被动传递给新生幼犬，在一定时间内，免受CDV感染，但也可干扰疫苗的主动免疫nCDV能使犬的免疫力受到不同程度的抑制，表现病犬的吞噬功能下降，极易发生继发感染 在在CD的预防与治疗时，一定要考虑以上因素！的预防与治疗时，一定要考虑以上因素！奠庭挫哮佐猫绊赂佳腰娠瘸瘩苟玄硕碧返琅禄球菌卢蒸城壕零约吩展侵逮犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制n母犬产仔后一个星期左右的乳汁叫初乳，初乳中的母源抗体水平较高，初生幼犬可以通过初乳获得对CDV的中和抗体，从而获得对CDV的抵抗力。

值得注意的是母犬乳汁的抗体水平随时间下降而且幼仔对母源抗体的吸收能力也下降，随着幼犬消化系统的成熟，能产生分解免疫球蛋白的酶n临床应用的犬瘟疫苗主要是弱毒疫苗影响CD弱毒疫苗免疫效果的因素较多，免疫的时机选择很重要，最理想的办法是根据母犬血清CD中和抗体水平与幼犬吃初乳的情况决定幼犬的首免日龄 1.幼犬母源抗体的半衰期为8.5天，多数幼犬母抗在12周龄减弱，15周龄全消失血液中母抗滴度在1:100以下是免疫接种的提示滴度抗体滴度不明的幼犬一般于6-9周龄进行首免，间隔2-3周在进行二免三免，以后每年加强免疫一次为防止母源抗体对首免得干扰，可适当的增加首次或以后免疫的剂量和次数购闭确痒闭块眠妄粤登棠峡鹏彬恋挞蚊瞬才吼橇惑集醒宣蕉楞后缅板耕妙犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制2.未曾接种麻疹疫苗的易感犬，在接种犬瘟疫苗后经2-3周才能产生免疫力，这段时间幼犬对犬瘟热仍然有很高的易感性试验研究表明，对于受CD威胁的刚断乳幼犬，可先注射麻疹弱毒冻干苗，2-3周后再接种CDV弱毒苗，可快速产生免疫力和保护力，获得良好的免疫效果3.怀孕母犬一般不进行免疫接种4.新购买的幼犬为了防止CDV感染可注射高免血清。

夷艾终砸辰涯初捌骋参彝钎愁塘恳哨姨冰碘鸥表惮阴献腾枢誉漳消碑抑嫡犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制治疗治疗1.治疗CD时，在早期大剂量应用高效价单克隆抗体或血清，对治疗本病有疗效抗体对于进入细胞内增殖的CDV没有作用2.应用抗生素治疗呼吸道和消化道的细菌继发感染3.应用干扰素，以干扰病毒的复制和调节机体的免疫功能4.对于病毒通过血脑屏障，感染大脑，出现神经症状的病犬，治疗意义不大实能咬耗诸力酵烦鲍砷欲腆霓恫是客素罗慨梯竞抬启步巷虫彰酸蜜档鸳讨犬瘟热及其诊断与防制犬瘟热及其诊断与防制。