激素性股骨头坏死模型建立及其发病机理探析.doc

激素性股骨头坏死模型建立及其发病机理探析作者：王伟刘利英 王坤正 马树强 党晓谦 时 志斌 柏传毅 赵小鸽【摘要】 目的建立兔激素性 股骨头坏死模型，探讨其可能的发病机制方法用改进的 马血清加甲强龙的方法诱导制备兔激素性股骨头坏死动物 模型，通过X线检查及组织病理学方法观察坏死模型建立情 况；采用免疫组化方法检测造模后2、4、8周兔股骨头内过 氧化物酶体增殖体激活受体 Y (PPAR Y)及骨形态发生 蛋白2(BMP 2)的局部表达情况结果模型组双侧股骨头 内骨质密度不均一，关节面模糊；骨小梁稀疏变细、断裂， 骨小梁骨细胞空骨陷窝明显增多，脂肪细胞体积增大，数目 增多，骨髓腔内造血组织明显减少造模后2、4、8周时， 模型组动物股骨头内PPAR Y表达逐渐增强；BMP 2在2 周时呈阳性染色，4、8周时转阴性结论用改进的马血清 加甲强龙的方法诱导制备兔激素性股骨头坏死动物模型，其 病理变化及影像学改变符合临床典型的股骨头坏死的特征； 激素性股骨头坏死的发生可能与PPAR Y表达增强、BMP 2 表达减弱有关关键词】激素性股骨头坏死；动物模型；免疫组织化 学；过氧化物酶体增殖体激活受体一Y;骨形态发生蛋白一2Construetion of the model of steroid induced osteonecrosis in rabbits and exploration of the pathogenesis of the osteonecrosis femoral headABSTRACT: Objective To construct the model of steroid induced osteonecrosis in rabbits and explore the pathogenesis of osteonecrosis femoral head・ Met hods We cons true ted the rabb it model of femoral head necrosis with the modified method of horse serum plus methylprednisolone・ The osteonecrosis model was evaluated by X ray photograph and hematoxylin and eosin stain； immunohistochemistry was performed to detect the dynamics of the PPAR Y and BMP 2 expressions inside the femoral head of steroid induced osteonecrosis in rabbits・ Results X ray photo graph showed tha t the femoral head was inhomogeneous in model group. In model group, there were increased numbers of empty bone lacunae and larger fat cells, decreased hematopoietic tissues compared with normal control group under light microscopy and histological staining. The expression of the PPAR Yin model group at the 2th, 4th and 8th week was obviously higher than that of control group・ Its expression had an upgrade tendency, with the longer time・ The expression of BMP 2 in model group was extremely lower than that in control group at the 2nd week. In 4th and8th week, there was no expression of the BMP 2 in model group・ Conclusion The typical animal model of osteonecrosis is induced by the modified method ofhorse serum plus methylprednisolone・ Inside the femoral head of steroid induced osteonecrosis in rabbits, the expression of the PPAR Y is upgraded； the expression of the BMP 2 is inhibited.KEY WORDS： femoral head necrosis； peroxisome proliferator actived receptor gamma； bone morphogenetic protein 2； animal model； immunohistochemsitry股骨头缺血性坏死是临床常见的难治性疾病之一，其 发病原因众多，发病机理尚不明确。

该病临床上分为创伤性 与非创伤性两大类，其中激素性股骨头坏死在非创伤性股骨 头坏死中发病率居首位，并呈逐年增高的趋势针对激素性 股骨头坏死的原因学研究，国内外学者提出了多种假说，但 迄今尚无一种学说可以完全解释其发病机理建立激素性股 骨头坏死动物模型时间长、成本大、成功率低、动物死亡率 高，因此对造模方法的研究仍将是长期面临的一项课题在 本研究中我们通过对已有造模方法进行改进，试图寻找一种 新的效率更高的造模方法，并在此基础上对激素性股骨头坏 死的发病机理进行了进一步的探讨1材料与方法1.1实验动物健康成年新西兰白兔35只（西安交通 大学实验动物中心），雌雄各半，体重2. 6-3. 2kg,平均2. 9kgo 颗粒饲料喂养，单笼饲养1.2 主要仪器与试剂 Rabbit Anti PPAR Y、Rabbit Anti BMP2、羊抗兔二抗（博士德生物工程有限公司）；兔SP 检测试剂盒（SP 9001,中杉金桥）；马血清（北京元亨圣马 生物技术研究所），甲强龙（美国辉瑞生物制药公司）；多聚 赖氨酸、多聚甲醛（博士德生物有限公司）；二甲苯、无水乙 醇、乙二胺四乙酸二钠（天津市化学试剂六厂）柯达计算机 X线摄影成像系统/CR； RM2135石蜡切片机（德国Leica公 司）；数显恒温水浴锅HH 2（国华电器有限公司）；202 2AB 电热恒温干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；显微镜 （Motic）； W550CW型图像信号采集与分析系统（德国Leica公 司）。

1. 3方法1.3.1动物模型制作及分组动物适应性喂养1周后, 精确称重，随机分为正常对照组（15只）和模型组（20只） 两组动物在体重及雌雄数等方面经t检验差别无统计学意 义首次应用马血清10mL/kg,经兔耳缘静脉注射，间隔3 周后，马血清减量为6mL/kg经兔耳缘静脉再次注射；间隔2 周后，腹腔注射甲基强的松龙，按45mg/kg连续3d,每天注 射1次注射激素期间，每天每只动物腹腔注射青霉素10 万单位，连续7d,预防感染正常对照组动物常规饲养1.3.2 X线检查 于最后1次激素注射后，4周末，两 组各取4只动物，氯胺酮复合麻醉（安定3. 5mg/kg肌注15min 后，氯胺酮25mg/kg肌注）后，拍双髓正位X线片1.3.3病理组织学检查 于最后1次激素注射后2、4、 8周末，两组随机各取4只动物，氯胺酮复合麻醉（同1.3. 2） 后，备皮、消毒、固定动物严格无菌手术下，取出双侧股 骨头，沿冠状面剖开，冷PBS冲洗后，将所取标本置于10%（体 积分数）中性甲醛溶液（0. lmol/L, pH=7. 4）固定3d,然后置 于10%（体积分数）EDTA Tris缓冲液中脱钙，每周更换脱钙 液1次，观察骨标本表面颜色并用物理法测定其脱钙程度。

脱钙完全后取材，逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片 行HE染色光镜观察骨组织、骨髓组织、骨小梁及髓内脂 肪组织的变化1.3.4免疫组化染色 如上法制备石蜡切片，常规免 疫组化染色其中PPAR Y和BMP 2抗体稀释均为1 ： 100, 与辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1 : 500)室温 孵育2h后，用DAB显色以PBS代替一抗作阴性对照棕 色颗粒代表PPAR V和BMP 2的阳性表达应用Leica公 司的Qwin软件分析免疫组化的结果每只动物随机选取3 张切片进行免疫组化染色，每张切片随机选取10个(X200) 视野，分析灰度值，取其均值代表本张切片的灰度值，3张 切片灰度值的均值为该动物免疫组化染色的灰度值染色的 深浅度与灰度值成反比，即组织细胞中PPAR Y和BMP 2 的表达越强，染色越深，灰度值就越低1.4统计学处理使用SPSS10. 0版统计软件，采用t 检验的方法进行组间数据的比较，P<；0. 05表示差异有统 计学意义2结果2.1病理组织学观察正常对照组：骨小梁完整，排 列规则，骨小梁中的骨细胞清晰可见，空骨陷窝少见，骨髓 中造血细胞丰富，脂肪细胞相对较少，形态正常；模型组： 骨小梁稀疏变细，结构紊乱，有碎片出现，骨小梁骨细胞陷 窝空疏，骨细胞核固缩，骨髓腔内造血组织明显减少，细胞 数目及网状结构较正常稀疏，脂肪细胞体积增大，有的融合 成泡状(图1)。

股骨头软骨下区空骨陷窝率及骨髓腔内脂肪 细胞直径的变化见表lo表1两组造模后2、4、8周末空骨陷窝率及髓腔脂肪细胞直径的比较（略）Tabel 1 Comparison of empty bone lacuna rate and diameter of fat cell between model and control groups at the 2nd, 4th, and 8th week*P<；0.05 vs. control group； **P<；0.05 vs.week 2图1正常对照组和模型组的HE染色结果（略）Fig. 1 HE staining observation of control and model groups (X400)A： control group, few empty osteocyte lacunae and many hematopoietic cells were seen； B： model group, a lot of empty osteocyte lacunae, decreasing hematopoietic cells and hypertrophy fat cells were seen2.2X线检查结果正常对照组股骨头形态完整，关节面清晰，股骨头骨密度均匀（图2A）；模型组股骨头关节面模 糊，骨质结构不清楚，股骨头骨质密度不均匀（图2B）。

图2正常对照组和模型组于造模后4周双侧X线表现（略）Fig. 2 After injecting steroid 4 weeks, the X ray photograph of control and model groupA： control group： intact articular surface with uniformity sclerotic structure of femoral head；。