纤维素酶类糖苷水解酶及其降解机理p培训课件.ppt

单击此处编辑母版副标题样式*1单击此处编辑母版标题样式纤维素酶类糖苷水解酶及其降解机理第四章4.1 导言l纤维素类生物质是自然界中最丰富的与淀粉在结构上的差别仅在于糖苷键连接方式不同l多与半纤维素、木素相互结合在一起l纤维素酶系统 非复合：真菌、放线菌 一般由菌丝分泌到胞外分别发挥作用 复合： 厌氧菌（热纤梭菌） 在其细胞壁上产生隆起的细胞结构，为纤维小体2 自从 1906年在蜗牛消化液中首次发现纤维素酶后，人类对其研究经历了百年历史： 1950-木酶的发现，C1-Cx假说 1980 年至 1988 年-利用基因工程的方法对纤维素酶的基因进行克隆和一级结构的测定 90年代-厌氧细菌纤维小体超分子复合体结构功能研究，多结构与体系的发现 21世纪-基因及氨基酸序列，分子时代导言3(3)-葡萄糖苷酶(-glucosidase,EC.3.2.1.21,简称 BG）,这类酶水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下降4.2 纤维素酶系统的组成54.3 糖苷水解酶家族l以底物专一性为基础建立的命名方法不能反映酶分子的结构特性l把作用于碳水化合物的相关酶类分成许多蛋白质家族，形成专门的数据库共享。

http:/www.cazy.orgl碳水化合物活性酶 (CAZy)分类系统，只对结构域进行定义 CAZy中某一基因的结构域以模块表示678l图4.294.4厌氧细菌纤维素酶的结构与功能 厌氧细菌在纤维素底物上生长时，在细胞壁上产生隆起的细胞结构即为纤维小体l不同生物体之间纤维小体结构相似，但其组成成分随着种的不同而有所差异l纤维小体结构复杂、体积庞大、异质性强104.4.1 纤维小体的一般组装模式l结构蛋白：初级脚手架蛋白，锚定脚手架蛋白等l催化模块：纤维素酶、半纤维素酶等114.4.1 纤维小体的一般组装模式对接模块粘连模块124.4.1 纤维小体的一般组装模式134.4.2 粘连模块与对接模块4.4.2.1 粘连模块l不同厌氧微生物的粘连模块序列差异很大l同一个脚手架蛋白上的粘连模块一般为同一类型，不同粘连模块之间有不同的序列相似性l目前型和型粘连模块晶体结构已测定厌氧细菌纤维素酶的结构与功能14154.4.2.2对接模块l由大约具22个氨基酸的两条重复序列组成l钙离子促使对接模块折叠，并使其形成稳定的三级结构也是粘连模块-对接模块相互作用所必需的l对接模块与其相应的粘连模块的分支情况相对应。

厌氧细菌纤维素酶的结构与功能16174.4.2.3粘连模块和对接模块相互作用l决定了纤维小体的结构，并纤维小体各亚基的整合仅依 赖于此l主要以疏水作用相联系，并辅以相对较少的分子间氢键l热纤梭菌中型粘连模块与对接模块的相互作用是目前已知最强的蛋白质间相互作用之一 厌氧细菌纤维素酶的结构与功能18l粘连模块与酶上对接模块在种内的结合是非专一性的，而在种间的相互作用却是专一性的生化水平上，包含对接模块的酶与包含粘连模块的脚手架间的结合本质上是非特异性的l对接过程中粘连模块总体结构本质上不变，对接模块发生了构象变化4.4.2.3粘连模块和对接模块相互作用19图4.4 热纤梭菌型粘连模块红色和型对接模块蓝色相互作用示意图204.4.3 纤维小体上的催化模块l以热纤梭菌为例，它既有纤维小体酶系，也有游离的非纤维小体酶区别纤维小体酶与游离酶的关键特征是，纤维小体酶带有对接模块 l催化模式具有多种情况：热纤梭菌中，表现为葡聚糖内切酶活性、持续降解的纤维素内切酶活性、纤维素外切酶厌氧细菌纤维素酶的结构与功能214.4.3.1典型的纤维小体外切酶（或持续性内切酶）的空间结构厌氧细菌纤维素酶的结构与功能22厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.3.2典型的纤维小体内切酶的空间结构Figure 4.4.3 Structural comparison of (/)6 glycosyl hydrolases 23l根据序列和结构的相似度，CBM可被分成不同的家族。

不同纤维小体家族中按功能分主要属于A型和B型4.4.4.1 脚手架上的CBM厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.4 碳水化合物结合模块CBM （carbohydrate-binding module) 图4.4 热纤梭菌脚手架蛋白上的CBM结构示意图 脚手架蛋白上往往包含一个CBM，它被认为负责将多酶复合体锚定在相应底物上（虽然在瘤胃球菌的纤维小体中没有发现）,其属于A型 热纤梭菌脚手架蛋白CBM的三维结构已经被解析其拓扑结构为一个由9个片层组成的果冻卷24l酶上的CBM不是保持酶复合体接近底物表面所必需的结构然而其具有潜在的功能，似乎是单个酶专一性结合底物，特别是其在分子水平上结合单个底物分子链（如可溶性的- 葡聚糖或木聚糖链）l酶分子模块上的CBM既有A型也有B型厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.4.2酶分子的CBM254.4.4.3纤维小体和游离酶上的CBM比较lCBM蛋白质的种类及其所属家族都是高度不同的l但部分在纤维小体和游离催化系统中是相同的l有些只存在于游离催化系统，而在纤维小体中完全不存在厌氧细菌纤维素酶的结构与功能264.4.4.4 影响小体与底物结合的因素l弱离子强度能抑制纤维小体结合纤维素。

l水分子能够从纤维素基质中释放至少部分的纤维小体或CBMl适当增加溶液中的盐含量可提高纤维小体对底物的亲和能力l吸附底物次优条件下，纤维小体复合体的酶活力最高厌氧细菌纤维素酶的结构与功能274.4.5纤维小体的多样性l根据纤维小体上脚手架蛋白的数量，可以被分为两类:第一类：解纤维梭菌、食纤维梭菌、约氏梭菌、丙酮丁醇梭菌、等嗜温梭菌产生的纤维小体只发现了型的粘连模块和对接模块69个）第二类：热纤梭菌、解纤维醋弧菌、黄色瘤胃球菌和溶纤维素拟杆菌复杂程度高 有限资料表明，纤维小体的组成和分布会受到碳源的影响，另外纤维小体的某些结构蛋白和催化组分基因的表达也受到生长速率的影响厌氧细菌纤维素酶的结构与功能28图4.5厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.5纤维小体的多样性29厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.5纤维小体的多样性30厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.5纤维小体的多样性314.4.6 纤维小体基因在基因中的分布规律厌氧细菌纤维素酶的结构与功能324.4.7 微型人造小体的研究进展l纤维小体实际上是一个微型而高效的纤维素降解机器现在已提出了通过理性人工设计并通过工程手段提高天然纤维小体降解活力的新思路 。

l可行性依据：1）对于细菌的粘连模块和对接模块，无论是单独生成还是移植到异源性的蛋白质上，它们都能忠实地保持自身的生物学性质2）二者高亲和力相互作用在一些产纤维小体的细菌种类之间具有物种专一性厌氧细菌纤维素酶的结构与功能33l与天然纤维小体相比，有三个主要的不同之处： 1）含有酶的数量有限 2）是同源性的 3）每个酶在微型手脚架蛋白上的位置是受到控制的l未来前景包括构建新的杂交手脚架蛋白，使之能够将三个或多个不同的酶结合到特定位点上嵌合体的稳定性也是影响它将来工业化应用的一个因素厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.7 微型人造小体的研究进展344.5好氧真菌纤维素酶的结构与功能l好氧真菌分泌的纤维素酶分子一般都由一个糖基化的连接肽将一个较大的催化结构域和较小的纤维素结合结构域连接起来构成354.5.1 催化结构域及催化断键机理l纤维素酶催化断键功能相似，但属不同糖苷水解酶家族lT.reesei是纤维素酶体系研究最为深入的好氧真菌其中CBH I是该菌所产主要的外切酶l催化中葡聚糖异头碳的构型并不发生变化l水解主要产物是纤维二糖好氧真菌纤维素酶的结构与功能36好氧真菌纤维素酶的结构与功能4.5.1 催化结构域及催化断键机理37l图4.9好氧真菌纤维素酶的结构与功能38l有待研究的问题：1.结晶纤维素表面如何游离出单根葡聚糖分子链。

2.单根葡聚糖链如何快速准确地进入CBH的催化孔道中 3.葡聚糖链如何在催化孔道中高效地持续性单方向运动4.5.1 催化结构域及催化断键机理好氧真菌纤维素酶的结构与功能394.5.2 纤维素结合结构与的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能l当多个不同蛋白质中都存在一个相同或相似的结构域时，该结构域称之为模块每一纤维素酶分子包含催化模块和碳水化合物模块（CBM）l基于结构和功能，将不同CBM分成三类：40好氧真菌纤维素酶的结构与功能4.5.2 纤维素结合结构与的结构与功能41lCBM的功能 推测其功能是将催化结构域拉近到不溶性的纤维表面，使纤维素水解过程易于进行但是其功能及催化中的分子机理仍未形成共识好氧真菌纤维素酶的结构与功能4.5.2 纤维素结合结构与的结构与功能424.5.3 链接区的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能l纤维素酶的模块结构通常由韧性的糖基化连接区连接在一起l其有效长度及柔韧性也是酶催化过程的关键l富含脯氨酸、苏氨酸和甘氨酸434.5.3 链接区的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能 虽然许多结构域三级结构已得到解析，但目前还没有一个包含完整纤维素酶的三维结构获得解析。

444.6 纤维素酶持续性降解结晶纤维素 的动态催化过程 结晶纤维素的降解是纤维素降解的关键限速步骤持续性作用的外切纤维素酶是降解结晶纤维素的主要酶类 可分为两个过程： 纤维素结晶超分子结构的破坏需外加能量） 糖苷键的断裂为酶催化反应，是动力学过程）454.6.1 纤维素酶分子-底物之间的结合过程纤维素酶通过结合结构域吸附到底物上；定位于底物表面上特定的化学键上；形成酶-底物复合物；-糖苷键的水解，同时酶分子沿着纤维素链前进；纤维素酶从底物脱吸附，或重复第4步，当催化结构域离开纤维素链时重复第2、3步；-葡萄糖苷酶水解纤维二糖形成葡萄糖 反应过程存在产物的抑制，及底物结构变化对酶分子催化过程的影响等因素纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程464.6.2 外切纤维素酶对底物分子的催化断键过程4.6.2.1 酶分子-底物复合物l待酶分子与底物结合构象变化形成稳定复合物后，催化断键是瞬间发生一般通过分子动力学/量子力学(MM/QM)，的方法进行研究l对外切纤维素酶CBH I 的分子动力学模拟，CBH I 的催化孔道与糖链之间有分子间氢键作用，糖分子所有的羟基与各种氨基酸残基相互作用，起到稳定酶-底物复合物的作用。

纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程474.6.2.2 共价糖基-酶中间体的形成l催化循环的第一步纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程4.6.2 外切纤维素酶对底物分子的催化断键过程484.6.2.3 异头碳的恢复纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程494.6.2.3 异头碳的恢复纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程504.6.3 外切纤维素酶催化降解结晶纤维素的分子内协同模型lCBH I的两结构域(CD与CBM)作用的分子内协同模型纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程内切酶外切酶CBM外切酶催化结构域514.6.4 外切纤维素酶持续性催化过程动力从何而来l分子动态学指出，大分子的动态行为与其功能密切相关l新的酶学研究认为酶分子执行功能时要完成一系列构象变化，在这个过程中酶分子整体结构“编码”了蛋白质分子的动态构象行为，为其提供“预先组织的环境”l对CBH来说，环境因素、底物结构变化、酶分子结构域协同作用等都会影响CBH高效持续性降解过程纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程52小结l这些相关研究在生物大分子相互作用水平上阐明酶分子降解结晶纤维素的限制因素，找出高效降解的充分条件，为降低转化过程的能耗、提高能量转化效率奠定理论基础，也为解决目前遇到的系列难题提供新思路，促进燃料乙醇新技术的革新与工业化转化进展。

纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程53单击此处编辑母版副标题样式*54单击此处编辑母版标题样式。