DNA限制性内切酶消化酶切.ppt

DNA限制性内切酶消化酶切 DNA restriction enzyme digestion,实验四,实验原理,限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA限制性内切酶可分为三类,Ⅱ类限制性内切酶,Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5',实验材料和试剂,实验材料： λDNA：购买或自行提取纯化 重组pBS质粒或pUC19质粒实验试剂： EcoR I酶及其酶切缓冲液：购买成品 Hind Ⅲ酶及其酶切缓冲液：购买成品 琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂糖均可实验仪器,恒温水浴锅,,DNA 1μg,反应 10×缓冲液2μL,重蒸水,19μL,1μL酶液,,+,用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底,混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3h,每管加入2μL 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，电泳检测,EP管编号, 加样,,,,实验步骤,对质粒DNA酶切反应,限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶, 消化1-2h。

但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长电泳检测示例,实验注意事项,限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶，消化1-2h但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应 许多实验制备的DNA不易于降解，需适当增加酶的使用量反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应 市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则酶活性将受影响思考题,如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被酶切或者酶切不完全, 你认为可能是什么原因？,。