医学细胞生物学课件第四章.ppt

第四章 细胞生物学的研究技术 Techniques in Cell BiologyPreparatory observe put forward theoretics Design control testsCollect data Explain results Devise conclusionRefer to knowledge 第一节 细胞形态结构的观察普通光镜普通光镜普通光镜普通光镜特殊光镜特殊光镜特殊光镜特殊光镜形态观察形态观察扫描扫描扫描扫描电镜电镜电镜电镜高压电镜高压电镜高压电镜高压电镜透射电镜透射电镜透射电镜透射电镜扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜相差显微镜相差显微镜相差显微镜相差显微镜微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜荧光显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜光学显微镜光学显微镜光学显微镜光学显微镜电子显微镜电子显微镜电子显微镜电子显微镜扫描探针显微镜扫描探针显微镜扫描探针显微镜扫描探针显微镜原子力显微镜原子力显微镜原子力显微镜原子力显微镜一、显微结构的观察一、显微结构的观察显微结构（显微结构（microscopic structure）-通过光通过光学显微镜观察到的细胞结构。

学显微镜观察到的细胞结构一）普通光学显微镜（一）普通光学显微镜（二）相差显微镜（二）相差显微镜（三）微分干涉差显微镜（三）微分干涉差显微镜（四）暗视野显微镜（四）暗视野显微镜（五）激光扫描共聚焦显微镜（五）激光扫描共聚焦显微镜（六）荧光显微镜（六）荧光显微镜普通光学显微镜普通光学显微镜目镜物镜集光器载物台光源最大分辨率最大分辨率 0.2m0.2m；最大放大倍数；最大放大倍数 10001000倍H-E染色后的上皮柱状细胞染色后的上皮柱状细胞相差显微镜相差显微镜(phase contrast microscope)倒置相差显微镜倒置相差显微镜环状光阑环状光阑相板相板荷荷兰兰物物理理学学家家 F.Zernike 于于1932年年发发明明：利利用用光光的的衍衍射射和和干干涉涉特特性性，把把透透过过标标本本不不同同区区域域的的光光程程差差转转变变成成振振幅幅差差，从从而而提提高高了了活活细细胞胞结结构构的的反反差差，解解决决了了对对活细胞观察的难题，获诺贝尔物理学奖（活细胞观察的难题，获诺贝尔物理学奖（1953）微分干涉差差显微镜微分干涉差差显微镜(differential interference contrast(DIC)microscope)Nomarski于于1952年在相差显微镜原理的基础上年在相差显微镜原理的基础上发明，其优点是能发明，其优点是能显示结构的三维立体投影影像显示结构的三维立体投影影像。

与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故差别更大，故影像的立体感更强影像的立体感更强DIC显微镜下的显微镜下的硅藻（伪彩色）硅藻（伪彩色）聚光镜中央有挡光聚光镜中央有挡光片，照明光线不直片，照明光线不直接进人物镜，只允接进人物镜，只允许被标本反射和衍许被标本反射和衍射的光线进入物镜射的光线进入物镜视野的背景是黑的，视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的物体的边缘是亮的暗视野显微镜暗视野显微镜(dark field microscope)能见到小至能见到小至 4nm的微粒子，分辨率可比普通显微的微粒子，分辨率可比普通显微镜高镜高50倍DIC显微镜显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜相差显微镜相差显微镜普通显微镜普通显微镜荧光显微镜荧光显微镜(Fluorescence Microscope)照明方式为落射式，即光源通过物镜投射于样品；照明方式为落射式，即光源通过物镜投射于样品；光源为短波光，分辨力高于普通显微镜；光源为短波光，分辨力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片，有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外等，间的用于滤除紫外等，用以保护人目。

用以保护人目分裂细胞的分裂细胞的分裂细胞的分裂细胞的免疫荧光图像免疫荧光图像免疫荧光图像免疫荧光图像抗原抗原抗原抗原(细胞的蛋白质成分细胞的蛋白质成分细胞的蛋白质成分细胞的蛋白质成分)特异性结合特异性结合特异性结合特异性结合荧光染料荧光染料抗抗抗抗 体体体体用激光作光源，在细胞不同焦距平面作断层扫描，用激光作光源，在细胞不同焦距平面作断层扫描，得到光学切片，并可整合为三维影像得到光学切片，并可整合为三维影像激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)二、亚微结构的观察二、亚微结构的观察亚微结构（亚微结构（submicroscpic structure）-细胞细胞中直径小于中直径小于0.2um的结构超微结构（超微结构（ultramicroscopic structure）-接接近分子水平的结构近分子水平的结构一）电子显微镜（一）电子显微镜（二）扫描探针显微镜（二）扫描探针显微镜用电子束作光源，用用电子束作光源，用电磁场作透镜，分辨电磁场作透镜，分辨力可达力可达0.2nm主要用于观察细胞内主要用于观察细胞内部结构。

部结构由于电子束的穿透力由于电子束的穿透力很弱，用于电镜的标很弱，用于电镜的标本须制成厚度约本须制成厚度约40-50nm的超薄切片的超薄切片透射电镜透射电镜(transmission electron microscope，TEM)电子束在样品表面扫描，样品产生的二次电子被电子束在样品表面扫描，样品产生的二次电子被收集、转换、放大后显示在荧光屏上收集、转换、放大后显示在荧光屏上扫描电镜扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)图像为立体形象，图像为立体形象，反映了标本的表面反映了标本的表面结构分辨力约为分辨力约为3nm加速电压大于加速电压大于120kV的透射电镜的透射电镜穿透力强，观察标本的厚度可达穿透力强，观察标本的厚度可达10um，已达一，已达一个完整个完整细细胞厚度可以得到可以得到细细胞内部的三胞内部的三维维精精细结细结构构图图象，如象，如细细胞胞骨架的立体网骨架的立体网络络高压电镜高压电镜(high voltage electron microscope)超薄切片技术超薄切片技术负染色技术负染色技术（染背景不染样品）（染背景不染样品）冰冻蚀刻复型技术冰冻蚀刻复型技术 扫描电镜样品制备技术扫描电镜样品制备技术电镜样品的制样技术电镜样品的制样技术冰冻蚀刻复型技术冰冻蚀刻复型技术 标本置于标本置于-196C液氮中冰冻后用冷刀骤然将标本液氮中冰冻后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为出断面结构，称为蚀刻（蚀刻（etching）。

蚀刻蚀刻蚀刻蚀刻断裂断裂断裂断裂蚀刻后，向断面以蚀刻后，向断面以45度角度角喷涂一层蒸汽铂，再以喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反度角喷涂一层碳，加强反差和强度然后用次氯酸差和强度然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为铂的膜剥下来，此膜即为复膜（复膜（replica）复膜显示出了标本蚀刻面复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断影像即代表标本中细胞断裂面处的结构裂面处的结构复膜复膜复膜复膜根据量子力学原理中的隧道效应而设计根据量子力学原理中的隧道效应而设计分辨率很高，横向为分辨率很高，横向为0.10.2nm，纵向可达，纵向可达0.001nm固态、液态和气态物质均可进行观察固态、液态和气态物质均可进行观察利用扫描隧道显微镜可直接观察生物大分子，如利用扫描隧道显微镜可直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope，STM)相对于扫描隧道显微镜，原子力显微镜不要求所相对于扫描隧道显微镜，原子力显微镜不要求所观察样品一定要有导电性，所以适用于任何生物观察样品一定要有导电性，所以适用于任何生物大分子的观察。

还可以在空气或各种溶剂体系中大分子的观察还可以在空气或各种溶剂体系中直接观察，故其适用范围有明显扩大直接观察，故其适用范围有明显扩大不会引起样品表面分子的漂移和损坏，其图象的不会引起样品表面分子的漂移和损坏，其图象的可重复性大大提高可重复性大大提高原子力显微镜原子力显微镜第二节 细胞的分离与培养细胞的分离与培养有效获得单一类型的细胞有效获得单一类型的细胞获得较大的细胞群体获得较大的细胞群体细胞工程方面的应用细胞工程方面的应用一、细胞的分离一、细胞的分离利用组织块制备细胞悬液，一般用蛋白水解酶处理利用组织块制备细胞悬液，一般用蛋白水解酶处理从细胞悬液中分离某种细胞：从细胞悬液中分离某种细胞：流式细胞仪流式细胞仪（flow cytometer,FCM）亦称亦称荧光激活细胞分选器荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting,FACS)二、细胞的体外培养二、细胞的体外培养一定条件下，大多数细胞都可以在体外存活并增殖，一定条件下，大多数细胞都可以在体外存活并增殖，而且可以表现出它在体内的一些分化特性而且可以表现出它在体内的一些分化特性1.1.1.1.细胞体外生长条件：细胞体外生长条件：细胞体外生长条件：细胞体外生长条件：培养基：培养基：培养基：培养基：必须氨基酸、维生素、动物血清、必须氨基酸、维生素、动物血清、必须氨基酸、维生素、动物血清、必须氨基酸、维生素、动物血清、糖、盐糖、盐糖、盐糖、盐支持物：支持物：支持物：支持物：塑料、玻璃，或包被包外基质塑料、玻璃，或包被包外基质塑料、玻璃，或包被包外基质塑料、玻璃，或包被包外基质其它条件：其它条件：其它条件：其它条件：pHpHpHpH值、值、值、值、COCOCOCO2 22 2、温度、湿度，、温度、湿度，、温度、湿度，、温度、湿度，无菌环境无菌环境无菌环境无菌环境等等等等原代培养：原代培养：由起始实验材料所进行的细胞培养由起始实验材料所进行的细胞培养传代培养：传代培养：对已有的细胞进行的继续培养对已有的细胞进行的继续培养细胞系：细胞系：通过原代培养所长出的细胞培养物通过原代培养所长出的细胞培养物有限性细胞系：有限性细胞系：不能传代或只能传少数几代不能传代或只能传少数几代连续性细胞系：连续性细胞系：能够连续地传很多代能够连续地传很多代永久性细胞系：永久性细胞系：能够无限地传代能够无限地传代细胞株：细胞株：由单一类型的细胞所组成的细胞系。

由单一类型的细胞所组成的细胞系一些有关细胞培养的概念一些有关细胞培养的概念2.2.2.2.体外培养细胞的特性体外培养细胞的特性体外培养细胞的特性体外培养细胞的特性形态特征：形态特征：形态特征：形态特征：上皮形、梭形、多角形、圆形上皮形、梭形、多角形、圆形上皮形、梭形、多角形、圆形上皮形、梭形、多角形、圆形增殖特性：增殖特性：增殖特性：增殖特性：一般细胞能传十代左右，一般细胞能传十代左右，一般细胞能传十代左右，一般细胞能传十代左右，少数细胞可传少数细胞可传少数细胞可传少数细胞可传40-5040-5040-5040-50代代代代 极少数细胞变成永久细胞极少数细胞变成永久细胞极少数细胞变成永久细胞极少数细胞变成永久细胞 人为分为人为分为人为分为人为分为 I II III I II III I II III I II III 三个时期三个时期三个时期三个。