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噬菌体展示技术课件•什么是噬菌体展示什么是噬菌体展示 　　是一项筛选技术，将外源多肽或　　是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的颗粒的表面，而编码该融合子的DNADNA则位于病毒粒子内　则位于病毒粒子内　•表型表型————————基因型基因型•展示肽展示肽————————编码基因编码基因使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定简介简介Landmarks of phage display • •1985 1985 第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽第一次发表噬菌体展示技术；展示多肽•Smith GP. Science.1985; 228:1315-7Smith GP. Science.1985; 228:1315-7• •1988 1988 噬菌质粒系统噬菌质粒系统• •1990 1990 抗体片段的展示抗体片段的展示• •1993 1993 展示展示cDNAcDNA文库文库• •1994/1995 1994/1995 研发了研发了‘ ‘phage two-hybrid’phage two-hybrid’技术技术• •1996 1996 首次体内首次体内in vivo in vivo 淘选试验淘选试验• •1998 1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体噬菌体展示载体作为基因导入载体• •1999 Combination of phage display with high-density arrays1999 Combination of phage display with high-density arrays• •2001 Automated phage display selection2001 Automated phage display selection• •Killing cancer cells by targeted drug-carrying phage nanomedicinesKilling cancer cells by targeted drug-carrying phage nanomedicines Published: 3 April 2008 Published: 3 April 2008 BMC Biotechnology BMC Biotechnology 2008, 2008, 8 8:37 doi:10.1186/1472-6750-8-37:37 doi:10.1186/1472-6750-8-37展示系统　Display SystemCell Based1、Phage Display2、Cell Surface DisplayCell Free 1、Ribosome Display2、mRNA Display噬菌体展示系统的分类 •根据噬菌体不同Phage M13, f1, fdT7, T4, lamda•根据载体不同Vector True Phage Phagemid•根据文库不同Library 随机肽库、cDNA文库、抗体文库、蛋白质文库M13噬菌体的组成和结构• •丝状噬菌体：丝状噬菌体：M13M13、、f1f1和和fdfd。

က က• •单链单链DNADNA病毒病毒,6407 bp,6407 bpက က• •基因组编码基因组编码1111种蛋白质，其中种蛋白质，其中5 5种为结构蛋白质种为结构蛋白质က က与展示密切相关的有两与展示密切相关的有两种结构蛋白质种结构蛋白质• •DNADNA在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，并且分泌大量噬在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，并且分泌大量噬菌体颗粒菌体颗粒Life Cycle of M13 • •pIIIpIII蛋白结合于蛋白结合于E.Coli E.Coli 的的F F纤毛纤毛; ;က က• •病毒病毒ssDNAssDNA进入细菌的胞浆合成进入细菌的胞浆合成dsDNAdsDNA；；က က• •以以dsDNAdsDNA为模版合成所有的病毒蛋白，且通过滚环复制合成组装病毒所需的为模版合成所有的病毒蛋白，且通过滚环复制合成组装病毒所需的ssDNAssDNA• •第一代噬菌体在感染第一代噬菌体在感染1010分钟后出现在培养液中（分钟后出现在培养液中（3737℃℃）က က• •感染后感染后1 1小时内平均每个细胞分泌小时内平均每个细胞分泌10001000个噬菌体。

个噬菌体次要衣壳蛋白pIII• •406 aa 406 aa 组成，组成，5 5个拷贝，位于噬菌体的尾部个拷贝，位于噬菌体的尾部က က由三个功能区组成：由三个功能区组成：ကကကကN1 N1 穿膜区：作用于穿膜区：作用于E.coliE.coli细胞膜上的细胞膜上的TolATolA蛋白；与噬菌体的入侵有关蛋白；与噬菌体的入侵有关ကကကကN2 N2 受体结合区：负责结合受体结合区：负责结合F F菌毛ကကကကCT CT 疏水区：组装前黏附在细菌内膜上；与噬菌体组装终止有关疏水区：组装前黏附在细菌内膜上；与噬菌体组装终止有关ကကကကG1G1、、G2:G2:甘氨酸片段，在感染过程中，增加各个功能域之间的灵活性甘氨酸片段，在感染过程中，增加各个功能域之间的灵活性主要衣壳蛋白pVIII•က က每个病毒子含约每个病毒子含约27002700个拷贝，约个拷贝，约10%10%能有效地融合外源能有效地融合外源多肽或蛋白以多肽或蛋白以pIIIpIII融合子方式表达的多肽是低价的，而融合子方式表达的多肽是低价的，而以以pVIIIpVIII融合子方式表达的多肽则是高价的（每个病毒子融合子方式表达的多肽则是高价的（每个病毒子~200~200个拷贝）。

个拷贝）•က က这种高价这种高价pVIIIpVIII展示所增加的亲和力有利于筛选到亲和力展示所增加的亲和力有利于筛选到亲和力非常低的配体，而低价非常低的配体，而低价pIIIpIII展示则将筛选限制在具有较高展示则将筛选限制在具有较高亲和力的配体上亲和力的配体上•က က所有所有Ph.D.Ph.D.文库都是文库都是pIIIpIII融合方式（每个病毒子展示融合方式（每个病毒子展示5 5个拷个拷贝的外源多肽）贝的外源多肽）pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同? pVIII pVIII 展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装• •pIIIpIII只要不影响感染，可以展示只要不影响感染，可以展示300 aa300 aa的多肽• •噬菌质粒能展示的蛋白已经达到噬菌质粒能展示的蛋白已经达到86 kDa86 kDa• •丝状噬菌体展示系统一般是在包膜蛋白丝状噬菌体展示系统一般是在包膜蛋白pIIIpIII或或pVIIIpVIII的的NN端融合外源多肽端融合外源多肽• •每个病毒子含５个拷贝的每个病毒子含５个拷贝的pIIIpIII蛋白，这五个蛋白都可以融合短肽而不影响蛋白，这五个蛋白都可以融合短肽而不影响噬菌体的感染力。

噬菌体的感染力• •拷贝数不同拷贝数不同噬菌体质粒－方便克隆、增强遗传稳定性方便克隆、增强遗传稳定性噬菌体质粒特征： က 携带有欲在噬菌体上融合展示的蛋白基因，没有其他噬菌体基因က 有质粒复制起点(322 ori)和噬菌体复制起点(f1 ori－用于合成ssDNA)က 有包装序列信号（packing signal）က 有供筛选的抗生素标记基因Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和病毒包装所需要的所有蛋白和酶（f1 oridefect)噬菌体展示技术流程 淘选的方法－亲和淘选 直接包被法淘选法：优点：简单直接缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入 可能是由于分子的立体封阻 或者是靶分子表面的部分变性而引起液相法：先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体-靶分子复合物亲和捕获于亲和介质上，如：链霉亲和素包被的表面建库：[例子]含编码12肽DNA序列为5’CATTCTCACTCGGCCGACGGGGC T(NNK)12GGGGCCGCTGGGGCCCAAACTGTTGAA 3’，其中N代表A、T、C、G四种碱基，K代表G、T两种碱基，(NNK)12为编码随机12肽部分，划线部分含有BglⅡ识别序列。

扩增---嵌合---噬菌体扩增亲和淘选•噬菌体肽库与靶分子相互作用噬菌体肽库与靶分子相互作用•洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体•将特异性结合的噬菌体洗脱下来将特异性结合的噬菌体洗脱下来•三轮淘选后，克隆测序三轮淘选后，克隆测序噬菌体展示的应用 • •抗原表位分析抗原表位分析• •• •制备特异性抗体制备特异性抗体• •• •制备疫苗、多价疫苗制备疫苗、多价疫苗• •• •构建新型的生物催化剂构建新型的生物催化剂• •如如Renet al (1997)Renet al (1997)将将T4 DNAT4 DNA连接酶展示于连接酶展示于T4T4噬菌体，所表达的融合蛋白能噬菌体，所表达的融合蛋白能够高效连接黏性或者平末端够高效连接黏性或者平末端• •有可能把催化某一代谢途径的多种酶展示到噬菌体上，制造人工的多酶复合有可能把催化某一代谢途径的多种酶展示到噬菌体上，制造人工的多酶复合体或者把成百上千个酶分子的活性位点展示到同一个噬菌体颗粒上，制造体或者把成百上千个酶分子的活性位点展示到同一个噬菌体颗粒上，制造superenzymesuperenzyme• •筛选酶抑制剂是寻找抑制酶活性肽段的理想工具。

筛选酶抑制剂是寻找抑制酶活性肽段的理想工具DennisDennis从肽库中筛选到非从肽库中筛选到非竞争性地抑制竞争性地抑制F VIIa F VIIa 活性的肽段活性的肽段噬菌体展示的应用 •蛋白质－蛋白质相互作用蛋白质－蛋白质相互作用•噬菌体噬菌体cDNAcDNA文库与芯片相结合文库与芯片相结合(a)(a)合成噬菌体合成噬菌体cDNAcDNA文库b)(b)生物淘选生物淘选c)(c)铺板，挑克隆入微孔板，为制备芯片做准备铺板，挑克隆入微孔板，为制备芯片做准备噬菌体展示的应用应用举例应用举例• •用病人用病人IgEIgE血清对血清对6 6种不同的种不同的cDNAcDNA文库淘选，文库淘选，5 5轮后，挑出轮后，挑出38,00038,000个克个克隆，鉴别了隆，鉴别了233233种蛋白，其中种蛋白，其中4747种为已知，种为已知，186186种是新的过敏源种是新的过敏源• •烟曲霉烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(Aspergillus fumigatus)已成为临床上仅次于白色念珠菌的一种已成为临床上仅次于白色念珠菌的一种重要的条件致病真菌重要的条件致病真菌• •草本枝孢草本枝孢( (小麦黑霉病菌小麦黑霉病菌) Cladosporium herbarum ) Cladosporium herbarum • •鸡腿蘑（鸡腿蘑（Coprinus comatusCoprinus comatus））• •皮屑牙胞菌皮屑牙胞菌(Malassezia furfur)(Malassezia furfur)• •花生和人肺组织花生和人肺组织Crameri, R. et al. (2001) Tapping allergen repertoires by advanced 　cloning technologies. Int. Arch. Allergy Immunol.124, 43–47噬菌体表面展示肽库优缺点•优点：优点：က ကM13M13无需体外包装无需体外包装က က电转化效率高电转化效率高, , က က库容量大库容量大2.8 2.8 × ×10109 9 က ကM13M13噬菌体纯化步骤简单，可加速淘选进程噬菌体纯化步骤简单，可加速淘选进程က က可避免细胞蛋白的污染可避免细胞蛋白的污染က ကAny ligand(natural or synthetic) Any ligand(natural or synthetic) 随机肽库随机肽库က က体内筛选器官特异性多肽体内筛选器官特异性多肽•缺点：缺点：က က仅适合展示小的多肽仅适合展示小的多肽( (=<20 =<20 氨基酸氨基酸) )က က载体容量载体容量<1 kb<1 kb；且有序列依赖性；且有序列依赖性က က不能筛选不能筛选Natural ligand(T7 cDNANatural ligand(T7 cDNA文库文库) )က က不能筛选不能筛选DNA-, RNA-DNA-, RNA-结合肽结合肽( (用用T7T7载体文库可以载体文库可以) )。