细胞学研究法报告微生物学研究所.doc

細胞學硏究法報告微生物學硏究所碩一 94334007陳桂貞培養基培養基依其來源及種類可分成犬然培養基以及人工合成的培養基天然培養基天然培養基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養基，如血漿、 血清、淋巴液、雞胚浸出液、蛋白質水解產物、酵母抽取物等組織培養技術建 立早期，體外培養細胞都是利用天然培養基但是由於天然培養基制作過程複 雜、批問差異大，因此逐漸爲合成培養基所取代合成培養基合成培養基是爲了硏究和了解細跑所需成分基礎所配製而成的，目的在於創 造出與體內相似的生存環境合成培養基有固定的組成成分，利於控制實驗條件 標準化合成培養基的應用極人的促進了培養細胞的發展合成培養基已成爲現 今普遍使用的培養基但合成培養基尙未成爲十分完全的培養基，它只能維持細 胞不死，不能促細胞增殖生長，使用時還需添加天然培養基，主要是牛血清牛 血清中含有促細胞增殖的各種生長因子和其它利於細胞生存的物質，因此當前使 用合成培養基時尙需添加天然培養基表1 •天然培養基和合成培養基優缺點的比較天然培養基合成培養基優點營養成分豐富，培養效果 好標準化生產，組分和含量 相對固定成本低缺點來源受限成分複雜，影響對某些實 驗產物的提取和實驗結 果的分析。

缺少某些成分，不能完全 滿足體外細胞生長需要合成培養基的種類人體內的細胞雖有共同的需要，但隨細胞種類不同又有所別因此合成培養 基的種類也很多當然有的培養基原初雖爲培養個別細胞所設計，而其適應性卻 很廣，能適於很多細胞生長，RPMI 1640就屬這類培養基不過在很多情況下， 還應加以選擇，選擇的條件除理論上考慮個別細胞的持殊生理需要外，重要的是 看其究竟能否使細胞生長增殖o所有合成培養基都含有一些共同成分，因此在組 成上大同小異，差異在於基本成分量的變化和少數特殊成分的存在與否最初'人們曾設想製備出不加任何天然成分的合成培養液一開始有人試驗 在生理鹽水中加入一些氨基酸或葡萄搪，發現可以延長雞胚組織存活的時間1960年在此基礎上，“199”合成培養液間世,開始了合成培養液的歷史199”培養液含有69種成分，幾乎包括了所有的氨基酸、維生素和一些核酸衍生物、 生長激素、脂類'加上硝酸鐵和Earle生理鹽溶液這是一個較爲複雜的合成培 養液，曾被廣泛用作各類細胞的培養，但事實上如只用“199”進行培養細胞， 僅能短期維持生存，細胞並不能長期生長和增殖'只有加了血清之後才能成爲生 長培養基後來在“199”的基礎上‘補加了還原劑、輔酶而省略了幾種B族維 生素'改良成爲“858”培養液。

它可以在不加血清的情況一卜，能支持幾種細跑 系較長時期地培養與此同時人們乂設計了一種更爲複雜的NCTC109培養液， 它能支持許多細胞系的生長雖然如此，在用這些培養基時，如果不加血清，對 大多數細胞來說仍只限於維持生存，卻不能使細胞長期生長和增殖且由於“199”和“109”等合成培養液由於成分較爲複雜，近年已很少使用目前常用的是後來設計的MEM Eargle培養液它僅含有12種必需氨基酸、 谷氨析胺和八種維生索，成分簡單，可廣泛適應備種已建成細胞系的培養同時， 易於添加或減少某些成分，也特別適於特殊硏究的細胞培養工作在它的基礎 上'之後又改良成DMEM (DulboccoMEM)DMEM增加了各成分的用量(加 倍)，葡萄糖用量可選擇高糖(lOOOmg/L)或低糖(4OOmg/L)，低糖對於生 長速度較快、附著性稍差的腫瘤細胞生長有利高糖則特別適用於附著性較差， 但乂不希望它脫離原來生長點的克隆培養效果較好，所以常用於雜交瘤技術中骨 髓瘤細胞和DNA轉染的轉化細跑的培養RPMI1640也是一種常用的培養液，最初是針對淋巴細胞的培養而設計問 世後發現它能廣泛適應許多種類的細胞的培養，包括正常細胞和腫瘤細胞的培 養，而且成分簡單，和MEM 一樣，應用己極其廣泛。

Mc-Coy5A和HamF12是兩種特殊用途的合成培養液Mo-Coy5A是一種爲肉 瘤細胞設計的培養液發現它除適用於原代細胞培養、組織活檢的細胞及淋巴細 跑生長外'還特別適用較難培養的細胞HamF12是在HamFlO基礎上改良的， 它們和其它合成培養液不同的是使用了一些微量元素的離子，如Cu2+、Zn2+、Fe3 +等可以在血清含量較少(2% — 10% )的情況下培養細胞，而且特別適用單 細胞的培養，因此常用作單細跑克隆化培養除上述幾種培養液外，還有許多種 其它培養基，但特點不明顯，不再贅述二、合成培養基的成分合成培養液的主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子和一些其它輔 助物質)氨機酸氨基酸是組成蛋白質的基本單位不同種類的細胞對氨基酸的要求各 異，但有幾種氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養液供給這幾 種氨基酸稱必需氨基酸其餘氨基酸爲非必需氨基酸，細胞可以自己 合成，或由其它物質轉化而來培養液中都含有必需氨基酸，幾乎所 有的細胞對谷氨西胺有較高的要求細胞需要谷氨西胺賴以合成核酸 和蛋白質，在缺少各氨西胺時，細胞生長不良而死亡所以各種培養 液中都含有較人量的谷氨西胺谷氨西胺在溶液中很不穩定，應置・20°C 冰凍保存，用前加入培養液內。

已含有谷氨西胺的培養液在4°C冰箱 中貯存兩週以上時，還應重新加入原來量的谷氨西胺細胞所能利用 的氨基酸是L型的同分異構體，D型氨基酸不能被利用雖然D型對 細胞無毒性，但在配製時應盡量采用L型，尤其是幾種必需氨基酸 如果沒有L型氨基酸，只好使用DL混合型代替，所用的量應是L型的 加倍表2•合成培養液中氨基酸所使用的濃度必須氨基酸：細胞生長所需，無法自行合成濃度(mM)L-Isoleucine0.4L-Leucine0.4L-Lysine-HCl0.396L-Methionine0.101L-Phenylalanine0.194L-Threonine0.403L-Try ptophan0.049L-Valine0.393L-Histidine-HCl-H2O0.2非必須氨基酸:細胞可自行合成濃度（mM）L-Alanine0.1L-Arginine-HCl0.6L-Asparagine-H200.1L-Aspartic Acid0.1L-Cystine-2HC10.1L-Glutamic Acid0.1L-Glutamine2.0Glycine0.1L-Proline0.1L-Serine0.1L-Tyrosine-2Na-2H2O0.199（二）碳水化合物碳水化合物是細胞生命的能量來源'而有的是合成蛋白質和核酸的成 分。

主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈿和醋酸鈿等三）維生素維生素是維持細胞生長的_種生物活性物質，它們在細胞中大多構成 晦的輔晦，對細胞代謝有重大影響維生素分爲水溶性和脂溶性兩人 類，配製時很重要水溶性維生素有硫胺、核黃素、泛酸、菸酸、菸 醋胺、毗哆醇、毗哆醛、葉酸、氧鉛胺素（VB12）、生物素、對氨苯 甲酸、膽鹼和肌醇等脂溶性維生素有維生素A、維生素D、維生素 E、維生索K等表3•維生素的種類與功能Vitamins功能D-Ca PantothenateB3傳遞 acyl groupsCholine chlorideB4形成acetylcholine，傳導神經衝動Folic acid傳遞一個碳的代替物，特別是formyl和 hydroxymethyl groups ； DNA 中 / 提供 methyl group for thyminei-Inositol形成IP3，做訊號傳導Niacinamide形成 NAD+、NADP+，Oxidation-reduction reactions involving two-electron transferPyridoxal HC1B6Transfer of groups to and from amino acidRiboflavinB2Oxidation-reduction reaction involving one- and two-electron transferThiamine HC1BlTransfer of two-carbon fragments containting a carbonyl group（四）無機離子無機離子是細胞的重要組成部分'並積極參與細胞的代謝活動。

例如 Na+,K+,C1可調控膜電位，Mg“可安定細胞狀態，C尹可增加細胞的吸附 性，作爲訊號傳遞分子，HHX與酸鹼値平衡有關，故爲細胞內維持滲 透壓、訊號傳遞及酸鹼値平衡等生理狀態的主要離子有的培養液中 還含一些微量元素如；F尹、Zn2+、C『+離子等探Sodium bicarbonate的加入只有平衡配製完成的培養基的pH値而 細胞培養期間，使細胞處於適合的pH値的環境是HEPES、Sodium bicarbonate、和C02來達成簡而言之，HEPES是爲了 NaHCOs而 加入，而CO?是爲了 NaHCOs而存在此三者共同維持細胞培養基 的酸鹼値，使細胞處於合適的生長環境五）其他成分在較爲複雜的培養液中還包含核酸降解物如瞟吩和嚅卩定類，以及氧化 還原劑如抗壞血酸、谷胱廿太等有的培養液中還直接採用了三磷酸 腺甘（ATP）和輔月每A細胞的培養基還會添加酚紅作爲培養基的酸鹼指示劑在培養基內添 加酚紅可以監控培養基的成分及細胞的狀態變化例如:由於細胞代謝 會產生酸性物質使得環性偏酸，培養基呈黃色時，即可以更換細胞培 養液不過也有不添加酚紅的培養基，例如：因爲酚紅具有螢光，能 干擾螢光檢測'所以以流式細胞儀檢測螢光的細胞於培養基內不添加 酚紅。

另外酚紅與類固醇激素（如雄激素與雌激素等）有相似的結構， 這在對腫瘤細胞硏究時可能引起非特異性激素效應因此作腫瘤細胞 硏究時培養基也不添加酚紅另外，爲了防止細菌污染，會在培養基內加入抗生素抗生素比例須 經過測試，否則會對細胞造成毒害，抗生索添加比例可見表4表4.抗生索使用種類與濃度使用濃度保存溫度抗微生物之種類Penicillin100 unit/ml-20°CG（+）bacteriaStreptomycin100 g/ml-20°CG（+，-）bacteriaChlotetracycline50 g/ml-20°CG（+，-）bacteriaGentamycin50g/ml-20°CG（+，-）bacteriaMycoplasmaAmphotericicin B2.5g/ml-20°CYeast，moldsNystatin50g/ml-20°CYeast ‘ moldsfungizone2.5 g/ml-20°CYeast 5 molds(六)血清血清內含各式各樣的生物分子，各自具有不同的調節細胞生理生 長的效果有的能促進細胞生長'有的卻能抑制細胞生長以下爲血 清所含的成分及其主要的功能：1. 生長因子(growth factor)EX.表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF) ‘ 是常見生 長因子的一種，促進表皮細胞、上皮細胞及間質的生長。

2. 賀爾蒙(hormones)可促進或抑制細胞的的生長和功能、並調控細胞的增殖和反 應。