吕梁黑山羊的体细胞克隆.doc

吕梁黑山羊的体细胞克隆 李希 王曦 吴苏君 罗惠娣 毛杨毅 贺东昌 周胜花 李春艳 张丽 郭慧慧 薛丽娜 党文庆 山西省农业科学院畜牧兽医研究所 摘 要： 研究旨在尝试利用体细胞克隆技术进行地方优良品种吕梁黑山羊的克隆保种剪取吕梁黑山羊耳缘组织, 通过组织块培养法获得了吕梁黑山羊皮肤成纤维细胞, 使用第 6 代的皮肤成纤维细胞作为供体细胞进行核移植, 将重构胚胎通过手术移植到受体辽宁白绒山羊母羊体内, 结果成功获得了 2 只体细胞克隆黑山羊, 生长发育状况良好, 且与供体黑山羊一致, 表明体细胞克隆技术是可行的这是山西省首例吕梁黑山羊克隆个体, 它的成功为优良地方品种改良、保种等研究提供了有效可行的方法, 为下一步进行吕梁黑山羊的转基因育种研究奠定了技术基础关键词： 吕梁黑山羊; 克隆; 保种; 核移植; 作者简介：李希 (1982-) , 女, 山西交城人, 助理研究员, 硕士, 主要从事动物细胞胚胎工程及克隆研究工作收稿日期：2017-08-17基金：山西省农业科学院科技自主创新能力提升工程项目 (2017ZZCX-02) Somatic Cell Cloning of Lüliang Black GoatsLI Xi WANG Xi WU Sujun LUO Huidi MAO Yangyi HE Dongchang ZHOU Shenghua LI Chunyan ZHANG Li GUO Huihui XUE Lina DANG Wenqing Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Shanxi Academy of Agricultural Sciences; Abstract： The objective of this study was to clone Lüliang black goat using the SCNT (somatic cell nuclear transfer) technology and to protect local variety. A piece of ear tissue was collected from Lüliang black goat and cultured to get skin fibroblast cells. The reconstructed embryos were produced by nuclear transfer using the G6 generation of Lüliang black goat ear firbroblast cells as donors and Liaoning white cashmere goat ooctyes as receptors, and we successfully cloned two lüliang black lambs on June 24, 2017 which were consistent with the donor. The result indicated that Lüliang black goat was successfully cloned by SCNT technology. This study obtains the first cloned offspring of Lüliang black goat, which will provide a effective feasible method for breeding, and lay a foundation for next step that produce transgenetic goats by somatic nuclear transfer.Keyword： Lüliang black goat; clone; breed conservation; somatic cell nuclear transfer; Received： 2017-08-17吕梁黑山羊是山西省地方优良品种之一, 主要产于山西西部黄土高原山区一带, 具有遗传性稳定、适应性好、抗病力强、耐粗饲、易抓膘、肉质鲜嫩等特点, 是山西省乃至全国珍贵的畜种资源, 有很高的经济生物种用价值。

但由于近年来对地方品种重视不够, 无序化杂交, 使得其经济实用价值受到严重影响, 品种资源保护也受到严重威胁调查研究发现, 吕梁黑山羊的数量不仅以惊人的速度锐减, 而且已处于濒危或灭绝的边缘, 如何更高效地保护吕梁黑山羊这一地方优良品种已经刻不容缓[1]传统的保种方法是建立活畜保种场, 但是, 活畜保种方法不仅成本费用高, 而且能够保存的品种以及个体数量有限体细胞克隆技术的成功为珍稀濒危物种保种提供了另一条有效途径体细胞克隆技术是将供体细胞通过显微操作的方法注射到去核的卵母细胞中构建重组胚, 经胚胎移植给受体产生存活后代的方法由于体细胞的保存方法成熟且效率高, 结合克隆技术, 能够实现动物在短时间内重现克隆技术在动物种质资源保护中具有独特的优势, 是动物活体保种的最有力辅助手段[2-3]本试验拟通过对吕梁黑山羊耳成纤维细胞培养及其克隆研究, 探讨保种的可行性, 旨在为今后山西省濒危动物保护和畜禽品种改良研究提供有效可行的方法1 材料和方法1.1 试验材料吕梁黑山羊的耳缘组织采自山西省农业科学院畜牧兽医研究所克隆基地试验羊场;受体羊为健康无病, 特别是无生殖系统疾病、且有良好繁殖记录的经产辽宁白绒山羊。

DMEM 和 TCM-199 购自 Gibco 公司;胎牛血清 FBS 购自 Hyclone 公司;FSH, PG 购自宁波市三生药业有限公司;CIDR 购自新西兰 Inter Ag 公司;维生素 ADE 注射液购自陕西西乡长江动物药品公司;胰蛋白酶, Na HCO 3, HEPES, DPBS, 二甲基亚砜 (DMSO) , Hoechst33342, 离子霉素, 6-DMAP 等均购自 Sigma 公司, 青、链霉素为国产细胞培养皿及胚胎培养 4 孔板购自 NUNC 公司1.2 试验方法1.2.1 吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞系的建立用镊子夹住双面刀片除净黑山羊耳毛, 依次用碘酒、75%酒精消毒干净, 拿采样钳剪取靠近耳尖的皮肤组织块 (1 cm) , 在有青霉素和链霉素的 DPBS 中洗 3 遍, 放入含有青霉素和链霉素的 DMEM 中, 封口膜封口, 4 h 内带回实验室在超净工作台中将组织块彻底除净毛发, 放入 75%的酒精中浸泡 30 s, 用 DPBS 漂洗 3遍, 在有培养液的培养皿中用消毒的眼科剪剔除掉结缔组织, 并把耳组织剪成约 1 mm 的小块, 接种到 60 mm 培养皿的底部, 使组织块均匀分布且有一定间距, 倒置培养于 37℃, 5%CO 2, 饱和湿度的培养箱中 6~8 h, 待组织块贴壁后, 沿皿壁加入含有 15%FBS 的 DMEM 培养液 4 m L, 使培养液慢慢浸没组织块, 培养 5~7 d 观察组织块周围有无细胞爬出, 待细胞生长至 80%汇合时, 进行传代培养或冷冻保存。

1.2.2 成纤维细胞的纯化依据上皮样细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的敏感性不同 (成纤维细胞对胰蛋白酶敏感, 脱壁快, 而上皮样细胞则不敏感, 脱壁慢;其次, 接种以后成纤维细胞也比上皮样细胞贴壁快, 大多数细胞能在 0.5~1.0 h 内贴壁, 而上皮细胞短时间内不能贴壁) 经过 2~3 次传代分离即可获得纯化的成纤维细胞1.2.3 成熟卵母细胞的采集1.2.3. 1 供体母羊的处理采用同期发情与超数排卵相结合的方法, 在发情周期的任意一天将阴道栓 CIDR放入供体母羊阴道, 放入 CIDR 第 1 天记为 0 d, 同时肌肉注射维生素 ADE 5 m L, 于第 14 天开始采用递减法注射超数排卵药物 FSH, 连续 3 d, 每天 7:00 和19:00 分别等量注射一次 (表 1) , 并在最后一次注射 FSH 的同时肌肉注射氯前列烯醇 PG 1 m L (0.1 mg) , 同时撤栓;撤栓 24 h 后利用公羊试情超排供体一般在最后一次注射 FSH 后 24~48 h 内发情表 1 FSH 的注射量 下载原表 1.2.3. 2 卵母细胞的采集手术前空腹 24 h, 将供体羊四肢固定并呈前低后高仰卧于手术保定架上, 臀部肌注 0.5 m L 鹿眠新麻醉, 剪毛并刮净毛茬, 常规消毒处理, 盖上手术创巾, 在乳房下 2~4 cm 处沿腹中线打开腹腔, 找到卵巢, 观察记录卵巢上的卵泡数及黄体发育情况, 然后在宫管结合部的子宫侧插入冲卵套管针, 注入 37℃冲卵液, 将卵母细胞从输卵管伞部冲出, 收集于离心管中。

然后换另一侧子宫角和输卵管, 方法同前收集的离心管立即带回实验室在体视显微镜下检查卵子情况, 挑选出形态完整、胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞作为体细胞核移植的受体细胞1.2.4 体细胞核移植将供体细胞和成熟的卵母细胞同时转移到显微操作液滴中, 操作液为添加 20 mmol/L Hepes 的 TCM199+10%FBS然后在倒置显微镜 (Olympus) 下用固定针吸住卵母细胞, 去核针去核, 选择大小合适光滑的单个成纤维细胞, 注入到去核卵母细胞的卵周隙操作 30~40 个卵后, 将重构卵转移到 TCM199 培养液中, 在 38.5℃, 5%CO 2, 饱和湿度培养箱中恢复 0.5~1.0 h, 然后检测重构卵完整性并进行激活操作1.2.5 重组胚的融合激活将恢复好的完整的重构胚胎分批转移到融合液中平衡 3~5 min, 然后每批 5 个放入电极宽度为 1mm 的已经铺满融合液的电融合槽 (BTX ECM2001 电融合仪) 中, 用自制拨卵针调节, 使供体细胞与卵母细胞相接触的界面与电极平行, 然后由 ECM2001 细胞融合仪施加 2 个直流脉冲, 2.0 k V/cm, 25μs, 间隔 1 s。

电击之后将经过电融合的重构胚转入 TCM199 中培养 0.5 h 后, 显微镜下观察其融合情况融合好的胚胎转移到含 5μmol/L 离子霉素的 TCM199 培养液中激活5 min, 然后转移到含 2 mmol/L 6-二甲基氨基嘌呤 (6-DMAP) 的 TCM199 培养液中, 在 38.5℃, 5%CO 2及饱和湿度的培养箱中培养 4 h最后转入 TCM199 培养液中培养1.2.6 胚胎移植和妊娠检测重构胚完成融合激活后, 立即进行胚胎移植挑选形态和发育较好的重构胚, 采用外科手术法移入同步发情的受体辽宁绒山羊母羊输卵管中同前, 母羊在手术前 24 h 内禁食禁水, 手术前刮毛, 并保定于手术架上同样在腹中线距乳房约 4 cm 处开口, 接着将子宫角和输卵管拉出, 观察记录卵巢上的黄体发育情况挑选黄体较多的一侧进行移植, 用带有 1 m L 注射器的移植针从输卵管伞部进针, 细心地将含有重构胚胎的液体缓缓注入, 然后慢慢拔出移植针每只受体移植 12 枚左右胚胎胚胎移植后 45~60 d 可进行超声波妊娠检测, 对怀孕的母羊调整饲养管理, 直至克隆羊出生2 结果与分析2.1 吕梁黑山羊耳缘皮肤成纤维细胞系的建立通过组织块贴壁培养法成功制备出了吕梁黑山羊的耳缘皮肤成纤维细胞。

组织块经过 5~6 d 的培养即可观察到细胞从组织块边缘向外迁出, 10 d 左右能清楚看到沿组织块周围生长出来的成纤维细胞从形态来看, 细胞主要呈梭形、长条状、多角形或不规则形, 且细胞之间有较大间隙, 排列疏松, 当细胞长到铺满皿底时, 呈放射状或漩涡状分布一般细胞生长到 70%~80%汇合时, 就立即将其进行消化传代或液氮冻存吕梁黑山羊的原代及传代成纤维细胞如图 1 所示2.2 克隆胚胎的构建本研究首先采集卵母细胞 292。