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氨基酸含量分析法 新增附录附录XX 氨基酸分析法 氨基酸分析法是指用于测定蛋白质、肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量的方法依据氨基酸组成分析可以对蛋白质及肽进展鉴别，氨基酸分析法可用于确定蛋白质、肽及氨基酸的含量，及测定可能存在于蛋白质及肽中的非典型氨基酸进展氨基酸分析前，必需将蛋白质及肽水解成单个氨基酸，详细水解方法由各品种项下规定蛋白质及肽水解后，其氨基酸分析过程与用于其他药物制剂中游离氨基酸的分析过程一样本法包括四种柱前衍生法，分别为异硫氰酸苯酯〔PITC〕法、6-氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯〔AQC〕法、邻苯二醛〔OPA〕和9-芴甲基氯甲酸甲酯〔FMOC〕法、2，4-二硝基氟苯〔DNFB〕法，以及一种茚三酮柱后衍生法不同的品种应针对自身所含的氨基酸种类及各氨基酸的含量选择相宜的氨基酸分析方法并做相应的方法学验证由于本法衍生过程中衍生溶液量较少，且简单挥发，外标法极易出现较大的误差，建议采纳内标法进展测定，内标确实定由各品种项下规定在本法中，由于半胱氨酸或胱氨酸的衍生产物不稳定，因此对于含半胱氨酸或胱氨酸的样品衍生后应尽快测定，或者在衍生前对半胱氨酸或胱氨酸进展适当的处理，使其转化为稳定地产物〔如磺基丙氨酸或半胱氨酸-硫代丙酸〕后再衍生测定，详细方法由各品种项下规定。

在测定过程中，可依据所用的仪器、色谱柱品牌、色谱柱的长度及要分别的氨基酸种类，对流淌相的有机溶剂和洗脱梯度作适当调整以获得较好的分别度第一法 PITC柱前衍生氨基酸分析法本法系依据氨基酸与异硫氰酸苯酯〔PITC〕反响，生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸〔PTC-氨基酸〕，PTC-氨基酸经反相高效液相色谱分别后用紫外检测，在必须的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比本方法的线性浓度范围为0.025～1.25μmol/ml试剂 〔1〕流淌相A 0.1mol/L醋酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至1010 ml)-乙腈(93:7) 〔2〕流淌相B 乙腈－水〔8：2〕参照品溶液 按各品种项下规定的方法制备 供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂〔4.6×250mm， 5μm〕；流速为每分钟1.0ml；柱温为40℃；检测波长为254nm各氨基酸峰间的分别度均应大于1.0洗脱梯度如下：时间(min)0 14 29 30 37 37.1 45流淌相A〔%〕101 85 66 0 0 101 101流淌相B〔%〕0 15 34 101 101 0 0测定法 精细量取氨基酸参照品溶液200μl，置一2ml塑料离心管中，精细参加1mol/L三乙胺乙腈溶液101μl，混匀，精细参加0.1mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液101μl，混匀，室温放置1小时，加0.8ml正己烷，猛烈振摇，放置10min，精细取下层溶液2μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精细量取供试品溶液200μl，自“置一2ml塑料离心管中”起同法测定。

其次法 AQC柱前衍生氨基酸分析法本法系依据氨基酸与6－氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯〔AQC〕反响，生成有紫外与荧光响应的不对称尿素衍生物〔AQC-氨基酸〕，AQC-氨基酸经反相高效液相色谱后用紫外或荧光检测，在必须的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比本方法的线性浓度范围为2.5～200nmol/ml试剂 〔1〕流淌相A 取醋酸铵10.8g或无水醋酸钠11.5g，加水900ml溶解，用磷酸调pH至5.0，然后加水至1010 ml 〔2〕流淌相B 乙腈－水〔3：2〕〔3〕0.4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 8.8) 取硼酸12.36g，加水400ml溶解，用40％氢氧化钠溶液调pH至8.8，然后加水稀释至500ml (4) AQC溶液 取AQC适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液参照品溶液 按各品种项下规定的方法制备 供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备色谱条件与系统适用新试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂〔4.6×250mm， 5μm〕；流速为每分钟1.4ml；柱温为37℃；检测波长为248nm各氨基酸峰间的分别度均应大于1.0洗脱梯度如下：时间(min)0 14 29 30 37 37.1 45流淌相A〔%〕88 88 80 59 59 88 88流淌相B〔%〕12 12 20 41 41 12 12测定法 精细量取参照品溶液10μl，置始终径为0.4cm、高度为5cm的小试管中，精细参加0. 4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 8.8) 70μl，在涡旋混匀器上混匀，精细参加AQC溶液20μl，混匀，精细量取5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精细量取供试品溶液10μl，自“置始终径为0.4cm”起同法测定。

第三法 OPA和FMOC柱前衍生氨基酸分析法本法系依据一级氨基酸，在巯基试剂存在下，首先与邻苯二醛〔OPA〕反响，生成OPA-氨基酸；反响完毕后，参加9-芴甲基氯甲酸甲酯〔FMOC〕，剩余的二级氨基酸与FMOC接着反响，生成FMOC-氨基酸，两次反响生成的氨基酸衍生物经反相高效液相色谱分别后用紫外或荧光检测，在必须的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比本方法的线性浓度范围为0.025～2.5μmol/ml试剂 〔1〕流淌相A 称取醋酸钠7.5g，加水4000ml溶解，加三乙胺800μl，四氢呋喃24ml，混匀，用2％醋酸调pH至7.2〔2〕流淌相B 称取醋酸钠10.88g，加水800ml溶解，用2％醋酸调pH至7.2，加乙腈1400ml，甲醇1800ml，混匀〔3〕0.4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 10.4) 取硼酸24.73g，加水800ml溶解，用40％氢氧化钠溶液调pH至10.4，然后加水稀释至1010ml〔4〕OPA溶液 取 OPA 80mg，加0.4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 10.4) 7ml，加乙腈1ml， 3-巯基丙酸125μl ，混匀 〔5〕FMOC溶液 取FMOC 40mg , 加乙腈8ml溶解。

参照品溶液 按各品种项下规定的方法制备 供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂〔4.6×150mm， 5μm〕；柱温为40℃；检测波长为338nm〔一级氨基酸〕，262nm〔二级氨基酸〕各氨基酸峰间的分别度均应大于1.0洗脱梯度及流速如下：时间(min) 0.0 17.0 45.0 45.1 50.0 50.1 53流淌相A〔%〕 101 50 0 0 0 101 1010 50 101 101 101 0 01.0 1.0 1.0 1.5 1.5 1.0 1.0流淌相B〔%〕 流速〔ml/min〕测定法 精细量取参照品溶液50μl，置一1.5ml塑料离心管中， 精细参加0. 4 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH 10.2) 250μl，混匀，精细加OPA衍生剂50μl，混匀，放置30秒，精细参加FMOC衍生剂50μl，混匀，精细量取4μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精细量取供试品溶液50μl，自“置一1.5ml塑料离心管中”起同法测定附注：1、由于OPA-氨基酸不稳定，因此衍生后应马上进展分别测定 2、本方法的衍生过程也可由自动进样器完成。

第四法 DNFB柱前衍生氨基酸分析法本法系依据氨基酸与2,4-二硝基氟苯〔DNFB〕反响，生成有紫外响应的二硝基苯-氨基酸〔DNP-氨基酸〕，DNP-氨基酸经反相高效液相色谱分别后采纳紫外检测，在必须的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比本方法的线性响应范围为30～140 pmol本法所用的2，4－二硝基氟苯属易爆、剧毒物质，有强致癌性，且该法对色谱柱要求较高，易损坏色谱柱，衍生试剂水解生成的2，4-二硝基苯易干扰丝氨酸的测定除另有规定外，一般不宜采纳本法试剂 〔1〕流淌相A〕 0.05mol/L醋酸钠溶液(取 4.1g无水醋酸钠，加水800ml溶解，加二甲基甲酰胺10ml，用稀醋酸调pH至6.4，用水稀释至1010 ml)〔2〕流淌相B 流淌相A-乙腈〔1：1〕参照品溶液 按各品种项下规定的方法制备 供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备色谱条件与系统适用新试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂〔4.6×250mm， 5μm〕；流速为每分钟1.0ml；柱温为40℃；检测波长为360nm各氨基酸峰间的分别度均应大于1.0洗脱梯度如下：时间(min)0 6 6.1 11 14 14.1 22 32 37 39 50流淌相A〔%〕75 75 65 59 59 50 45 10 10 75 75流淌相B〔%〕25 25 35 41 41 50 55 90 90 25 25测定法 精细量取氨基酸参照品溶液2ml，置一50ml量瓶中，加0.5mol/L碳酸氢钠溶液2ml，2，4-二硝基氟苯衍生化试剂〔量取2，4－二硝基氟苯1ml ，用乙腈稀释至101ml〕1ml，混匀，在60℃水浴中反响 1小时，取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另精细量取供试品溶液2ml，自“置一50ml量瓶中”起同法测定。

第五法 茚三酮柱后衍生氨基酸分析法本法系依据氨基酸经阳离子交换色谱柱分别后，与茚三酮反响，一级氨基酸生成在570nm处具有最大汲取的紫色化合物，二级氨基酸〔如脯氨酸〕生成在440nm具有最大汲取的黄色化合物，分别在570nm和440nm下检测上述反响产物，在必须的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比本方法的线性响应范围为20～500 pmol试剂 〔1〕流淌相A 取无水柠檬酸钠1.7g，盐酸1.5ml，加水溶解并稀释至101ml，用盐酸调pH至3.0〔2〕流淌相B 取无水柠檬酸钠1.7g，盐酸0.7ml，加水溶解并稀释至101ml，用盐酸调pH至4.3〔3〕流淌相C 取氯化钠5g，无水柠檬酸钠1.9g，苯酚0.1g，加水溶解并稀释至101ml，用盐酸调pH至6.0〔4〕 色谱柱再生溶液 取氢氧化钠0.8g，加水溶解并稀释至101ml，用盐酸调pH至13〔5〕柱后衍生试剂 取茚三酮18g，茚氮兰0.7g，加76.7％二甲基亚砜－0.7二水合醋酸锂－0.1％醋酸溶液900ml使溶解，在氮气下混合至少3小时〔6〕样品缓冲液 2％无水柠檬酸钠-1％盐酸-0.5％硫代二乙醇－0.1％苯甲酸溶液。

参照品溶液 按各品种项下规定的方法制备 供试品溶液 按各品种项下规定的方法制备色谱条件与系统适用新试验 用磺化苯乙烯－二乙烯苯共聚物为填充剂〔4.0×120mm， 7.5μm〕；流淌相流速为每小时14.0ml；柱后衍生试剂得流速为每分钟7ml，反响器温度为135℃；检测波长为440nm(一级氨基酸)，570nm〔二级氨基酸〕各氨基酸峰间的分别度均应大于1.0洗脱梯度如下：起先时用流淌相A平衡色谱柱，在25分钟流淌相的组成变为101％流淌相B，在37分钟，流淌相组成变为101％流淌相C，在75min，最终一个氨基酸被洗脱后，用色谱柱再生溶液再生色谱柱1分钟柱温程序如下：起先时柱温48℃，11.5分钟后，以每分钟3℃的速率升至65℃，约35分钟后，以每分钟3℃的速率升至77℃，最终在约52分钟后，以每分钟3℃的速率降至77℃测定法 精细量取氨基酸参照品溶液适量，注入氨基酸分析仪，记录色谱图；另精细量取供试品溶液适量，同法测定附注：不同品牌的氨基酸分析仪，应依据仪器的要求，对流淌相、色谱。