标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量.doc

原则曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、 原则曲线一般用分光光度法测物质的含量,先要制作原则曲线，然后根据原则曲线查出所测物质的含量因此，制作原则曲线是生物检测分析的一项基本技术二、 蛋白质含量测定措施1、 凯氏定氮法2、 双缩脲法3、 Fｏｌin－酚试剂法4、 紫外吸取法5、 考马斯亮蓝法三、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—原则曲线制作(一)、试剂：1、 考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝Ｇ—250 100ｍｇ溶于５０ml 95%乙醇，加入1０0ml 85%　Ｈ3PO４,雍蒸馏水稀释至10０0mｌ,滤纸过滤最后试剂中含0.01%（W／V）考马斯亮蓝G—250,4.7％(W/V）乙醇,８.5%（W/V）H３PO42、 原则蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同０．１５mｏl／LNａＣｌ配制成100ug/ml蛋白溶液二)、器材:1、７22S型分光光度计使用及原理(）２、移液管使用（)三)、原则曲线制作：试管编号0123４5６100ug／ml原则蛋白(mｌ）0.０0．１0.2０.30．40.50.６0.15mol/Ｌ　ＮaCl （ml)10.9０．80.7０.60.５０.4考马斯亮蓝试剂 (ml）5５5555５摇匀,1h内以1号管为空白对照,在５9５nm处比色A595nm1、2、以A5９5ｎm为纵坐标,原则蛋白含量为横坐标(六个点为１0ug、20 ug、３0 uｇ、40 ug、50 uｇ、6０　ｕg），在坐标轴上绘制原则曲线。

1）、运用原则曲线查出回归方程2）、用公式计算回归方程3)、或用oriｇｉn作图 　,测出回归线性方程即Ａ59５nm=ａ×Ｘ（ 　)＋6一般有关系数应过０.９９9以上，至少2个9以上4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应当在直线两侧四)、蛋白质含量的测定:样品即所测蛋白质含量样品（含量应解决在所测范畴内），根据操作环节1操作,测出样品的A59５nm，然后运用原则曲线或回归方程求出样品蛋白质含量一般被测样品的A595nｍ值在0.1—0.05之间,因此上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nｍ值，然后再计算五）、注意事项:1、 玻璃仪器要洗涤干净2、 取量要精确3、 玻璃仪器要干燥，避免温度变化4、 对照:用被测物质以外的物质作空白对照药物的配制(磷酸缓冲液的配制)一、药物的配制环节(一)、实验准备：1、 准备所需的药物和玻璃仪器2、 洗涤如何洗涤算干净？)(二)、计算:1、比例浓度计算:1)、Ｇ/V比例如配1％ ＮaCl，称1ｇ NaＣｌ溶于１00ml　水2)、Ｖ/Ｖ比：例如配75％乙醇100ｍｌ，7５%×100％=1０0%×Ｘ, 　X=75ml取７5ml无水乙醇,加２5ml蒸馏水。

乙醇：乙醚：丙酮=２：１:2配5０0ml,各取２０0 ｍl，1００ mｌ,２0０　ml混合３)Ｇ/V比：用的较少，如计算灰分中某种元素如Fe的含量2、摩尔浓度计算:注:药物的分子量一般在标签中注明1)、0.１M或０.1moｌ/L NaCl配100ｍlM=质量/体积(L)称取NaCl０.1×0.1×40＝0.４ｇ 摩尔数=G(g）/摩尔质量２）、0.1mＭNaCl配100ｍlmM=毫摩尔数/体积（Ｌ) 称取NaCｌ0.1×0.1×40＝0.４g 毫摩尔数=Ｇ（mｇ)/摩尔质量３）、０.1ｕNａCl配100ｍｌmM=微摩尔数/体积（L) 　 称取NａCｌ0.1×0．１×4０=0.4mg微摩尔数=G（ｕg）/摩尔质量 称取NaCl０.1×0．１×4０=０.4ｕｇ 3、 混合溶液配制的计算:如配3ｕMEDＴＡ，2.２5ｍM NBT以及6０uＭ 　 　　 溶液１00ml,用５０ｍM磷酸缓冲液配制注意:1、分别标定体积计算2、分别配制再混合,但总体积不能 为100ml（三）、标量：1、 根据需要选择不同量程的天平根据规定去不同精度的测量器，如量筒或移液管2、 电子分析天平的使用。

四）、溶解：1、 根据药物配备规定选择溶剂蒸馏水，双蒸水，无离子水等2、 只能用烧杯溶解注意加入溶剂只能加入总体积的2/３左右，剩余溶剂洗涤烧杯三次左右,直到洗涤干净小常识:药物标签中一般标记有药物的溶解性能和分子式，可根据分子式和所学的常识判断药物的构造和性质特点（涉及溶解性质)如酸碱两性物质的配制（AA、蛋白质、核苷酸等)如果溶解性能不好可以用稀酸或稀碱增进溶解，但pH应在被规定的范畴内3、 加热增进溶解,但注意应在配制的范畴内有的药物还需水溶加热较好如:配0．１%的淀粉，水裕加热（温度在８0-9０C)，过量会糊化五）、定容:1、 用容量瓶定容；2、 用玻璃棒引流或用小漏斗;3、 用溶剂加入到接近刻度,然后用滴管加入到刻度规定刻度与液体凹面相切为止(眼睛可视)；4、 上下窑洞容量瓶几次,混合均匀即可注意不再定容了，避免溶液漏掉六)、装入试剂瓶，贴上标签标签应注明如下内容:药物浓度、名称、配制人、配制日期等七)、清理实验场合二、磷酸缓冲液的配制一)、配制0.2mol/L即0.２M pH=6.8的磷酸缓冲液用磷酸氢二钠—磷酸二氢钠做缓冲液选用药物:Na2ＨPＯ4·12Ｈ２O(碱）和NaH2PO4·12H2O（酸）配缓冲液10０ml。

书中阐明二)、计算　：1、 注:书中有注明配备的量2、 计算:Nａ２HPO４·12Ｈ２O称取71.6４×0.1=7.164ｇNaＨ2PO4·12H2O称取 3１.２1×0.１=３.121g3、 具有不同结晶水的换算书中配1/15mol/L的缓冲液配1L,书中用Na2ＨPＯ4·2H2O需要1１.87ｇ/Ｌ但用Na２HPO４·1２H２O需多少g?11.87=(178/358)×X,Ｘ＝２3.8７g三）、分别配制缓冲液各１00ml（根据需要拟定配制的量)即:0.2M　　Nａ２HＰO４·２H2O和NaH２PO4·2H2O100ml四)、按书中的量配制取量再混合如：pH＝6.8,分别去缓冲对４９mｌ和51ml五）、用ｐH试纸ｃeni索赔的缓冲液的ｐH值，检测配备与否精确六)如配５０mM　pH =6.8的缓冲液１00ml ，以你配制的母液稀释即可计算：５０×0．１=0.2×1000×Ｘ （L）；Ｘ =0.0２5L；取0.2M pH=7.2的缓冲液25ml，用蒸馏水定容至１０0ｍl即可。