棉花GhERF14基因在拟南芥中的功能验证.docx

棉花GhERF14基因在拟南芥中的功能验证赵龙飞袁玥明聪摘要：随着分子生物学的不断开展，在模式植物拟南芥中初步探索分析基因功能的方法日渐成熟为了探索棉花GhERF14基因的功能，构建过表达载体，通过转基因技术转入拟南芥中，通过筛选纯化获得纯合体转基因植株，观察表型，发现GhERF14基因对拟南芥的生长状况有一定的抑制作用，初步分析基因的功能为后续研究奠定一定的根底关键词：拟南芥;GhERF14基因;功能验证1材料野生型、拟南芥大肠杆菌感受态DH5α、农杆菌菌株GV3101，植物过表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS〔含KnptⅡ基因〕由本实验室保存2试验方法2.1拟南芥pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14过表达载体的构建过表达载体在试验前期已经构建好的目的基因与带有35S的过表达载体连接即可，方法可参照目的基因与PMD19-T的连接方法2.2电击法转化pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14重组质粒转移到农杆菌GV3101将验证好的质粒利用电击的方法转入农杆菌GV3101中2.3拟南芥侵染液配制将含有pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14重组质粒的农杆菌新鲜菌液1‰参加含有50mg/L的Kan、50mg/L的Rif的新鲜灭菌LB液体培养基中，置于28℃、200rpm的恒温摇床30～36h，直至菌液呈橘黄色，菌液OD600值为0.6左右为止。

缓冲液配置500mL体系：MSMedium1.185g、蔗糖25g、Swillter-77150μL、乙酰丁香酮〔AS〕500μL4℃，5000g离心沉淀摇好的菌液，弃上清，用配制好的缓冲液在冰上悬浮，直至OD600值为0.5左右为止【1】2.4拟南芥的侵染利用农杆菌介导法转化拟南芥，取已经盛开的拟南芥植株，用剪刀去除果荚和花败的花，将花蕾浸泡于已经配制好的侵染液中，花蕾充分接触侵染液，时间不超过1min，对侵染结束的植株进行遮光处理24h，温度为23℃每间隔5～7d侵染1次，直至拟南芥生育期结束，收取拟南芥T0代种子，去除杂质，放于37℃恒温烘箱中24h后进行筛选鉴定2.5拟南芥DNA的提取以及PCR检验取适量的新鲜拟南芥叶片，利用无菌研钵在液氮中研磨，然后根据Magen公司生产的植物DNA提取试剂盒的说明书进行，对提取的拟南芥DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，对DNA质量好的模板进行PCR检验【2】2.6转基因拟南芥的生长状况调查将转基因拟南芥与野生型拟南芥在温度、光照、湿度相同的生长环境下进行培养，观察转基因植株和野生型植株在苗期、抽薹期、成熟期的生长状况3结果与分析3.1拟南芥的遗传转化及阳性植株筛选将验证正确的含有pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14的农杆菌GV3101，利用农杆菌介导法转化拟南芥，对T0代种子进行50mg/L浓度的Kan检验收取阳性植株，对T1、T2、T3植株单株收取种子，并对T1代植株叶片提取DNA，进行PCR凝胶电泳检测【3】。

3.2拟南芥转基因植株表观形态在T1代分别选择2个株系进行单株收种，然后分别在相同的环境下种植并进行筛选纯化，分别以T2-1、T2-2作为标记转基因拟南芥植株与野生型相比苗期生长较慢，生育期延后当野生型抽薹后，T2-1、T2-2才刚刚长满叶，通过比照T2-1、T2-2发现：T2-1相比T2-2长势更弱、更慢推断这可能与农杆菌侵染的染色体的部位不同局部有关，T2-1植株长势最慢，可能是A、D染色体同时被侵染，双供体侵染，具体原因还有待进一步探究可以看出该基因可能与植株的生长发育有一定的关系当转基因株系开始抽薹时，野生型株系已经接近成熟，野生型株系比转基因T2-2提前15d比照T2-1、T2-2株系，T2-2株系明显比T2-1生长得快，当T2-2株系抽薹后4d，T2-1才刚刚开始抽薹可以看出，棉花GhERF14不仅影响棉花的生长，甚至会推迟生育期【4】转基因拟南芥盛花结荚时与野生型相比，其生育期晚了15～20d当转基因株系与野生型株系都接近成熟时，野生型的株高和植株分枝情况都大于转基因株系同时转基因株系T2-1与T2-2相比也比较弱，分枝更少，T2-1长势更弱，分枝少，说明棉花GhERF14严重影响了植株的生长发育和分枝状况。

4讨论与小结通过观察转基因植株与野生型生长状况和生长势的差异发现，转基因植株长势比较弱，生育期延后植物抗病防御反应的调控是非常复杂的，有许多转录因子家族扮演着重要的角色，对后续试验有一定的借鉴意义通过该试验发现，该基因不仅可以调控植株对枯萎病菌的抗性，还具有调控植株生长发育的作用，但是针对拟南芥中是否对枯萎病有响应还有待探究，为该基因在生物学功能方面的研究奠定了根底，有利于下一步试验的开展，对后续试验有一定的借鉴意义参考文献：[1]ConcatenateLuis，AndersonJonathanP，YoungJodi，etal.AtERF14，amemberoftheERFfamilyoftranscriptionfactors，playsanonredundantroleinplantdefense[J].PlantPhysio-logy，2021，143〔1〕.[2]趙曾强.棉花GhWRKY44和GhWRKY22基因的克隆及功能初步分析[D].石河子：石河子大学，2021.[3]SinghK，FoleyRC，Oate-SnchezL.Transcriptionfactorsinplantdefenseandstressresponses[J].Curr.opin.plantBiol，2021，5〔5〕：430.[4]RushtonPJ，SomssichIE.Transcriptionalcontrolofplantgenesresponsivetopathogens[J].CurrentOpinioninPlantBiology，1998，1〔4〕：311.。