大学生科研项目申报书.pdf

信 阳 师 范 学 院 大 学 生 科 研 项 目申 请 书项目类别（在相应序号上划○ ）1.人文社会科学研究项目②自然科学研究项目所属学科：植 物 学课题名称：茶树 II型核糖体失活蛋白基因的克隆与表达分析申请者：朱 小 佩所学专业：植 物 学系 （ 院 ） 名 称 ：生 命 科 学 学 院申请日期：2009 年 10 月 10 日信 阳 师 范 学 院 制项目名称茶树 II型核糖体失活蛋白基因的克隆与表达分析项目所属学科领域植物学研究类别A A.基础研究B.应用研究成果形式○1 、学术论文2、著作3、调研报告4、文艺作品5、科技制作6、其他申请经费总额800 元起止时间2009.10 至 2010.9 项目主持人及成员情况类别姓 名所学专业科研特长系（院）名 称班级科研分工主持人朱小佩植物学基因表达与调控生命科学 学院2008 级研究生班负 责项目组 其他 成员杨会敏植物学基因表达与调控生命科学 学院2007 级研究生班基因表达量 检测曾 威植物学基因克隆与DNA 分析生命科学 学院2009 级研究生班基因克隆贾 晓植物学植物微生态学生命科学 学院2008 级研究生班基因克隆李向阳生物科学植物转基因生命科学 学院2007 级本科 2 班RNA 的提 取与反转录刘 颖生物科学植物组织培养生命科学 学院2007 级本科 1 班材料管理、 各种处理指导 教师姓 名专业科研方向系（院）名 称职称签名袁红雨植物学植物基因表达与调控生命科学 学院教授冯志国遗传学基因工程生命科学 学院讲师项目主要研究内容和目标(200 字以内 )：本项目的主要研究内容包括：①利用 RACE 技术克隆茶树II型核糖体失活蛋白基因 （RIP） 的全长 cDNA ；②利用半定量PCR技术检测茶树根、茎、叶、花、籽等器官中RIP基因的表达量，研究该基因的组织特异性表达； ③利用荧光定量PCR技术研究机械伤害、假眼小绿叶蝉取食、茶尺蠖取食和病原感染对II型RIP基因表达的影响。

本项目的研究目标是获得II型核糖体失活蛋白基因的全长cDNA序列和基因组DNA序列，并阐明其表达调控，为利用该基因培育抗虫转基因植株创造条件论证报告一、本课题研究本课题的实际意义和理论意义害虫是造成农作物、蔬菜、果树减产的主要因素之一，防治害虫危害是农业生产中的关键目前，对害虫的防治主要依赖于化学农药，它在短期内能起到杀灭害虫的作用，但长期使用会污染环境，危害人类健康，同时还能导致害虫对杀虫剂产生抗药性，降低药效植物抗虫基因工程技术是现代生物技术研究领域的重要成果，为害虫防治开辟了新途径利用基因工程手段培育抗虫植物具有以下优点：抗虫基因在植物体内稳定地遗传及表达，使植物获得稳定的抗虫性状；育种周期短、 目的性强； 不存在环境污染问题等分离高效的抗虫基因一直是植物抗虫基因工程领域的重要研究内容本课题研究的茶树II型核糖体失活蛋白基因，编码II型核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Proteins, RIPs)，它是一类能在真核细胞中通过破坏核糖体结构从而抑制蛋白质生物合成的毒蛋白它由 A链和 B链组成， A链具有 rRNA N-糖苷酶活性， B链是一个对半乳糖专一的凝集素，可与真核细胞表面的糖蛋白或糖脂的半乳糖部分结合，帮助A链进入细胞。

在细胞内，A链就可以破坏核糖体，抑制蛋白质的合成目前，人们还不清楚RIPs 的生物学功能，不能明确地回答为什么植物要合成和积累RIPs然而，体外检测和植物转基因研究结果均表明RIPs 对病毒具有广谱的抗性，对植物病原菌和昆虫也有选择性抗性，所以RIPs 被认为参与植物的自身防御机制本研究一方面对深入研究茶树的抗虫机制起着重要作用，另一方面从茶树抗虫品种中分离新型、高效的抗虫基因，为农作物抗虫基因工程做出贡献二、本课题的研究内容、特色和创新之处，预计突破哪些难题1）研究内容①利用 RACE 技术克隆茶树II型RIP基因的全长cDNA序列；利用PCR技术克隆茶树II型RIP基因的基因组序列②利用荧光定量PCR技术检测茶树根、茎、叶、花、籽各器官中RIP基因的表达量, 研究该基因的组织特异性表达③分别对茶幼叶材料进行机械伤害，假眼小绿叶蝉取食，茶尺蠖取食和病原感染的处理，提取RNA ，反转录为cDNA ，利用荧光定量PCR技术检测不同处理材料中RIP 基因的表达情况2）特色和创新之处与 I 型 RIP 相比， II型 RIP 只在少数植物中被分离出来关于II型 RIP在植物抗虫基因工程中的运用尚未见报道。

首次从受刺吸式口器昆虫危害的茶树叶片中分离受害虫取食诱导的II型 RIP 基因，这表明茶树的II 型 RIP 很可能参与了茶树诱导抗性的形成3）预计突破的难题：克隆获得RIP基因的全长三、本课题的研究方法、步骤、可行性论证，研究工作总体安排及进度和预期成果1）实验方法及步骤：①利用 RACE 技术克隆茶树II型RIP基因全长cDNA ：利用 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)从冷处理 24 h 的茶树叶中提取总RNA ；按照 Clontech公司 SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit的操作程序构建 5'-ready RACE cDNA文库和 3'-ready RACE cDNA文库；根据已克隆的该基因cDNA片段的核苷酸序列设计一对特异性引物，分别以以5'-ready RACE cDNA文库和 3'-ready RACE cDNA文库为模板，扩增该基因 cDNA的 5' 末端和3' 末端，拼接后得到该基因的全长cDNA ；根据拼接出的序列，在起始密码子附近和3' 非翻译区设计一对特异性引物，以SMARTTMRACE cDNA为模板扩增茶树II型RIP基因的 ORF ，并把扩增产物插入到pMD19-T载体中。

②利用 PCR技术克隆茶树II型RIP基因的基因组序列：利用在起始密码子附近和3' 非翻译区设计一对特异性引物扩增该基因的基因组序列，并将该基因的cDNA序列和基因组序列进行比较③分别提取茶树根、茎、叶、花、籽各器官中RNA ，转录为 cDNA 利用荧光定量PCR技术检测各器官中RIP基因的表达情况④分别以受假眼小绿叶蝉取食、受茶尺蠖取食、病源感染及受机械伤害的茶幼叶为材料，提取RNA ，构建 cDNA ，利用荧光定量PCR方法检测RIP基因在不同刺激下的诱导表达情况2）可行性分析：我们实验室一直致力于研究茶树中与抗逆相关基因，已开展的工作包括基因克隆、消减cDNA文库和全长 cDNA文库的构建、基因表达量的测定，Southern 杂交、 northern杂交、蛋白质的体外表达、植物转基因以及酵母双杂交等，目前，我们已经从茶树中分离出一批具有研究价值和应用前景的基因，其中包含II型核糖体失活蛋白基因的EST ，这为我们克隆该基因的的全长cDNA序列打下了很好的基础该课题中要使用到的荧光定量PCR技术是一项近年来发展起来分子生物学技术，广泛应用于基因表达分析，而在本课题中要对不同处理样本之间进行RIP 基因表达分析， 因此荧光定量PCR技术是至关重要的，我们实验室具备运用该技术的实验设备和条件，并运用该技术开展了多项工作，也已发表了相关文章。

这些前期工作及实验条件为本课题的展开打下了较为坚实的基础3）研究具体安排及进度：2009.10 －2010.01 克隆茶树II 型RIP基因的全长cDNA序列和基因组序列2010.01 －2010.04 分别提取茶树根、茎、叶、花、籽各器官中RNA ，转录为cDNA 利用荧光定量PCR技术检测各器官中RIP基因的表达情况2010.04 －2010.07 对材料进行机械伤害，假眼小绿叶蝉取食，茶尺蠖取食和病原感染的处理，提取RNA ，转录为 cDNA 利用荧光定量PCR技术检测不同处理材料中RIP基因的表达情况2010.07 －2010.09 解决实验中存在的问题，对整个实验内容进行必要的补充和完善，进行课题总结4）预期成果：从茶树抗虫品种中分离新型、高效抗虫基因；对RIP基因进行表达分析，为在抗虫基因工程领域应用II型 RIP基因提供指导四、研究工作的资料、设备等准备情况1）研究工作的资料我们首先查阅了大量的相关文献，主要参考文献有：[1]Hazarika LK. Bhuyan M, Hazarika BN (2009) Insect Pests of Tea and Their Management. Annu Rev Entomol, 54:267–84. [2] 石春林 ,朱祯 , 徐鸿林 (2000) 转基因烟草中Bt 毒蛋白基因的表达行为. 植物学报 , 42: 269-271. [3] 李雪艳 , 杨勇 , 许维岸 (2002) 植物蛋白酶抑制剂及其在植物基因工程中的应用. 生命的化学 , 22: 270-273. [4] 梁辉 , 朱银峰，朱祯，孙东发 , 贾旭 (2004) 雪花莲凝集素基因转化小麦及转基因小麦抗蚜性的研究.遗传学报， 31：189-194. [5]Park SW, Vepachedu R, Sharma N, Vivanco JM (2004) Ribosome-inactivating proteins in plant biology. Planta, 219: 1093-1096. [6]Stirpea F, Bolognesia A, Bortolottia M, Farinia V (2007) Characterization of highly toxic type 2 ribosome-inactivating proteins from Adenia lanceolata and Adenia stenodactyla [7]Chen Y, Peunans WJ, Van Damme EJM (2002) The Sambucus nigra a type 2 ribosome-inactivating protein SNA-I ’ exhibits in plan ta antiviral activity in transgenic tobacco. FEBS, 516:27-30. [8]Liu YG, Chen YL (2007) High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. BioTechniques, 43: 649-656. 我们实验室已开展的工作包括基因克隆、消减cDNA文库和全长cDNA文库的构建、Southern杂交、northern杂交、蛋白质的体外表达、植物转基因以及酵母双杂交等，并且从茶树中分离出一批具有研究价值和应用前景的基因。

在此基础上，我们已经从茶树抗虫品种凫早2 号中分离出一个受假眼小绿叶蝉取食诱导的II型核糖体失活蛋白基因2）使用的主要仪器：定量 PCR分析仪，电泳仪，凝胶成像分析仪，PCR扩增仪，制冰机，研究系统显微镜，超净工作台，离心机，恒温水浴器，摇床，培养箱，冷冻干燥机，超低温冰箱，超纯水组合系统等指导教师意见：II型核糖体失活蛋白具有抗虫和抗病毒的功能，从茶树中分离新型的核糖体失活蛋白基因，并研究其表达调控，能够为在抗虫基因工程领域应用II型核糖体失活蛋白基因创造条件该研究内容完整，技术手段先进， 技术路线合理、 可行 通过完成论文可以培养该生的科学素养和创新精神，提高其科研能力同意申报指导教师（签字） ：2009 年 10 月 10 日系（院）意见同意申报系（院）负责人（签章）：2009 年 10 月 10 日学校意见负责人（签章） ：年月日。