[精品]细胞实验报告-叶绿体提取和荧光观察.doc

叶绿体提取和荧光观察【摘要】叶绿体足植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物 学、遗传学和分子生物学的重要研究对象叶绿体是植物细胞中较大 的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究关键字】叶绿体提取荧光观察【背景介绍】叶肉细胞中的叶绿体内含叶绿素，使植物呈现绿色叶绿 体是细胞内扁平的椭球形或球形的三个双层膜细胞器之一，叶绿体内 基粒是光合作用的场所高等植物（如葫芦薛）的叶绿体呈椭球状， 在不同的光照条件下，叶绿体可以运动，改变椭球体的方向，这样既 能接受较多的光照，又不至于被强光灼伤在弱光下，叶绿体以其椭 球体的正面朝向光源；在强光下，叶绿体以其椭球体的侧面朝向光源 因此，在不同光照条件下采集的葫芦薛,观察到其小叶内叶绿体的形 状不完全i样将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的 常用方法一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状 和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关通过控制离心力和离 心时间等因素，不同的细胞器可以通过阶梯离心的方式得到分离在 一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度 不同。

依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗 粒 按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部.分批收集即可获得各种 亚细胞组分叶绿体的分离应在等渗溶液（O.35mol/L氯化钠或0.4moJ/L蔗糖 溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤将匀浆液在 lOOOr /min的条件下离心2min,以去除其中的组织残渣和一些未被破 碎的完整细胞然后，在3000r/min的条件下离心5min,即可获得沉 淀的叶绿体（混有部分细胞核）分离过程最好在0-5C的条件下进 行：如果在室温下，要迅速分离和观察荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一 种技术某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进 入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射 光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光.若停止供能荧光现 象立即停止有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称 为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧 光等有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发 出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附口丫嚏橙 后可发桔红色荧光。

叶绿素吸收的光能主要用于光合作用多余的能量可能以热的形 式散发，也可能以激发光的形式散发这种激发光就称为叶绿素荧 光叶绿素荧光检测技术作为一种强大的工具，广泛应用于生态学和 植物生理学研究利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的 影响，如温度、光、淬灭剂等因此在荧光观察时应抓紧时间，有必 要时立即拍照另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片,益玻片和无荧光油实验材料】试剂：0.35M氯化钠等渗溶液、新鲜菠菜;仪器：天平、匀浆机、离心机、烧杯、纱布、普通光学显微镜、荧光 显微镜等；【实验方法】1. 取干净的菠菜叶子的下表皮的薄薄的一层儿乎透明的一•层做成 装片进行观察，在普通显微镜以及荧光显微镜下分别观察气孔、 保卫细胞等并照相；2. 称取一份30克新鲜菠菜叶子，去除叶梗、叶脉水洗干净后用 纱布擦干；3. 放入匀浆机中，加150ml 0.35M氯化钠等渗溶液，高速挽拌3分 钟4. 将匀浆液用6层纱布过滤到烧杯中5. 取4ml过滤液于离心管中进行离心，1000r/min , 2min.6. 将上清液取出于另一只离心管中进行离心，3000r/min , 5min.7. 保留两次离心的上清和沉淀。

将最后一次的沉淀重悬浮于2ml 0.35M氯化钠等渗溶液8. 用最后的沉淀的悬液制作滴片，先在光镜，然后是荧光镜下观察 最好抓住时间和时机进行拍照9. 实验结束收拾好实验台；【注意事项】1. 在选择菠菜叶子时，选择新鲜嫩绿的叶子进行实验；2. 搅拌时最好保证完全搅拌，保证细胞器的分离率；3. 显微观察以及荧光显微观察时注意调节，同时要有耐心，不可过于急躁；4. 照相时抓住时机，仔细观察；【实验结果】1）在普通和荧光显微镜下观察叶子的下表面的表皮：在普通显微镜下观察的气孔及保卫细胞以下是在荧光显微镜的的图片用最后的沉淀制的悬液在普通显微镜以及荧光显微镜下: 以下是悬液在普通显微镜下观察到的叶绿体：以下是在荧光显微镜下观察到的叶绿体的红色荧光:【实验分析】1、 在未进行搅拌，只是取叶片的下表面时，要注意不要重叠，越 薄越好，容易观察；2、 实验过程的每个步骤比较简单，主要还是在显微镜下观察时要 特别注意，尽量调节视野，使之容易记录，观察到明显的实验 现象；3、 实验过程中可以用分离的上清液作为对比，从而使实验结果更 明显；4、 制片时注意所取的悬液尽量适量，保证视野的叶绿体的数量， 以免观察到明显的实验现象；【实验结论】用离心的方法分离得到细胞器叶绿体，在显微镜下可观察叶绿 体，同时在荧光显微镜下也可以观察到红色的荧光，从而确定细胞器 的形态。

参考文献】1、 蔡文琴.现代实用细胞与分子生物学实验技术[M].北京：人民 军医出版社，2003. 132、 《分子细胞生物学》第三版韩贻仁主编高等教育出版社；。