免疫荧光 双标.docx

免疫荧光步骤（双标）1. 冰冻切片制备将脱水后的脊髓标本放于冰冻托盘上，加OCT使组织被完全包埋，置于冰冻切片机中，调节箱体温度为-22°C，冷冻头温度为-23°C观察OCT冻成白色固态状时，将其放置于冷冻头，准备切片设置切片厚度为8pm，必要时用刷子辅助将切好的OCT薄片贴附于载玻片上室温下晾干载玻片后保存于-20C冰箱免疫荧光染色（1）室温下晾干切片15min,待完全晾干后放置于湿盒内，PBS冲洗浸泡5min/次，3次（以除去OGT）2）抗原修复液（IX）（双蒸水稀释），95-100C加热约20分钟（加热时间可以控制在10-30分钟内）20-30分钟内冷却至室温°PBS冲洗5min/次，3次3）用滤纸吸干玻片上残余PBS,用免疫组化笔在标本周围画一适当大小圆圈，避免接触标本，将配置好的封闭液（5%驴血清=920ulPBS+50ul驴血清+30ul10%trition）加入圆圈内，室温下封闭1h（4）用滤纸吸去封闭液，向标本加入相应一抗：（1%BSA兔源一标：兔抗IL-33（1：50）小鼠源二标：小鼠抗NeuN（1：500，神经元）小鼠抗GFAP（1:300，星形胶质细胞）小鼠抗OX42（1：100，小胶质细胞）小鼠抗OLIG2（1:25,少突胶质细胞）一抗于4°C静置过夜孵育。

5）次日，PBS洗去一抗，10min/次，3次，用滤纸吸干PBS,之后操作均需避光，向标本加入相应二抗：Dylight488标记驴抗兔IgG（1：300），Dylight594标记驴抗小鼠IgG（1：300），二抗室温静置避光孵育2h6）PBS清洗二抗，10min/次，3次，清洗后晾干后滴加DAPI封片，加盖玻片后于荧光显微镜下拍摄图片并保存计划：X2个配比浓度X2X2X22) 1.IL-33组：1)IL-33/NeuNIL-33/GFAPIL-33/Iba-1只孵二抗IL-33/GFAPX1IL-33/Iba-1X1只孵二抗需要购买：Triton-100，驴血清，一抗：小鼠抗RBF0X3/NeuN、小鼠抗GFAP、小鼠抗0X42,二抗：Dylight488标记驴抗兔IgG,BSA（牛血清白蛋白）注意：1、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证最佳的结构，并利于抗体与抗原结合通常情况下，需要通过以下步骤得以实现：细胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的TritonX-100进行通透前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。

使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用2、抗体特异性免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原使用只有二抗染色的片子作为阴性对照有利于减少降低背景干扰3、合适的抗体稀释比例通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度如果是第一次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验4、优化缓冲液和封闭剂尽管很多抗原在常见的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善Rockland可提供优化过的IHC用封闭缓冲液，同样适用于荧光染色实验5、选择正确的二抗如果您需要做免疫实验，我们强烈建议您选择进行过预吸附的二抗进行单染实验；如果是双重甚至是多重染色，那么必须使用预吸附的二抗。

同时，请优先选择来自同一物种的二抗6、使用合适的细胞密度选择合适的细胞数量进行染色，当细胞数量过多时，细胞结构不好，导致染色背景深，低细胞密度，会使细胞贴壁不佳，状态不好7、多重染色对同一样本进行两个不同抗原的检测时，可以用各自的抗体进行同时染色，但要求两个一抗的种属来源不同，标记物不同，而二抗的种属来源需保持一致8、降低背景高背景是免疫荧光常见的问题，解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替BSA做封闭液，降低抗体浓度，增加洗涤次数，洗涤至少三次，每次五分钟，推荐洗涤液为PBS+0.05%Tween?9、封片作为免疫荧光的最后一步，可以提高折射率，保护样品10、数据分析观察整体样片时，选择具有代表性的细胞进行数据获取与分析。