酚氯仿法提取DNA主要步骤和原理.doc

酚氯仿法提取DNA主要步骤：1. 将动物组织放在1.5ml的离心管中，分別用75%、50%洒精和纯水梯度脱洒精每个梯度 脱水时间为5-10min2. 将组织放入研钵中，加入适量DNA裂解液(300f.il),研磨后再加入300plDNA裂解液冲 洗研磨棒3. 将研磨好的组织液用移液枪加到1.5ml离心管，在管中加10卩1蛋白酶K,用封口带将离心 管封口，放入摇床(56°C,5h)4. 加入等体积的Tris饱和酚(500pl)，摇匀(lOmin).5. 离心：12000R, 7min, 4°C离心后分成上中下三层，上层为DNA.中层为蛋白质，下层 为有机质6. 吸取上层液体加入新的离心管7. 配制Tris饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1在含有上清液的离心管中加入Tris饱和酚、氯仿和异戊醇混合液450卩1,摇匀10mino9.离心：12000R, 7min, 4°C10•吸取上淸液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液400x1(氯仿：异戊醇=24:1)11. 离心:12000R, 7min, 4°C12. 吸取上淸液加入新的离心管，加入2.5倍经过-20°C冷冻的100%的酒精。

20°C过夜13. 将样品取出，12000R, 7min, 4°C离心14. 弃上淸，留白色沉淀(DNA),加400卩1的75%的经过-20°C冷冻的洒精，反复吹打溶解15•重复第14步骤2次(用75%洒精洗三次)16.提取DNA完成漠氯仿法提取DNA的原理：用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了 DNase的降解作用用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA联 结键已断，蛋白分子表而又含有很多极性基团与苯酚相似相溶蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2.抑制了 DNase的降解作用缺点：1•能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly (A) RNAO 2.不能完全抑制RNase 的活性氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点：加速有机相与液相分层最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚酚易溶于氯仿中）用酚一氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡异戊醇可以降低表而张力，从而减少气泡 产生另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下 层有机溶剂相维持稳泄。

用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或NaAc, Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如lmol/LM化钠）， 但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）则在0.14mol/L氯化钠 中溶解度最大，利用这一性质可将英分开将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分 离开加入固体氯化钠使苴浓度达到lmol/L,使DNA溶解加氯仿-异戊醇去除蛋白质， 也可重复该步操作得较纯DNA最后用95%乙醇沉淀DNAo溶解：将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次加4 亳升10%SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1 %左右，边加边搅拌，放It 60 °C水浴保温 10分钟（不停搅拌），冷却加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到lmol/L,充分搅拌10 分钟；除杂质：加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟，8000 r/min离心7分钟，取上层 液量好体积，倒入饶杯中（离心管），加同体积的氯仿-异戊醇混合液，重复上次操作。

直至 界面不出现蛋白凝胶为止；沉淀：准确量取上清液体积，加2倍体积95%冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白 色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心7分钟，得白色沉淀；溶解：将沉淀物用0」mol/L NaOH约10亳升溶解.得DNA溶液溶液I一溶菌液：溶菌酶：它是糖昔水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中 的p-1,4糖昔键，因而具有溶菌的作用当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制葡 萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解EDTA： （1） 螯合Mg2+、Ca24-等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时 需要一定的金属离子作辅基）；（2） EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反 应要求有较低的离子强度的环境溶液II一NaOH-SDS液：NaOH：核酸在pH大于5,小于9的溶液中，是稳龙的但当pH > 12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性在溶液II中的NaOH浓度为0.2mol /L,加抽提液时，该系统的pH就髙达12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性 SDS： SDS是离子型表而活性剂。

它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶 解膜蛋白而破坏细胞膜2）解聚细胞中的核蛋白3） SDS能与蛋白质结合成为 R-O-SO3-...R4-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来但是SDS能抑制核糖核酸酶 的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase 去除RNA时）受到干扰溶液III-3mol / L NaAc （pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8,必须 加入大疑的冰醋酸所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液用pH4.8的NaAc溶液是为 了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳左存在而 高盐的3mol /LNaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而 沉淀之前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS 一蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全为什么用无水乙醇沉淀DNA?用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方 法乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安 全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳泄存在，当加入乙醇时，乙醇 会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合一般实验中，是加2倍体积的无水 乙醇与DNA相混合，苴乙醇的最终含量占67%左右因而也可改用95%乙醇来替代无水 乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵）但是加95%的乙醇使总体积增大，而 DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会 影响收得率折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤 要使用无水乙醇也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA0 一般在室温下放15- 30分钟即可在用乙醇沉淀DNA时，为什么一圧要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1〜0.25mol/L?在 pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一左浓度的NaAc或NaCl,使Na+中 和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA 钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造 成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好在沉淀的DNA中，由 于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？加进去的RNase本身 是一种蛋白质，为了纯化DNA,又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉 淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更 加完全也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase.在溶液中，有人以KAc代替Na Ac, 也可以收到较好效果7.为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？在基因操作实验中，选择缓 冲液的主要原则是考虑DNA的稳泄性及缓冲液成分不产生干扰作用磷酸盐缓冲系统(pKa =7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范用(pH),可作DNA的 保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2 +产生Ca3(PO4)2沉淀：在 DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则 要求低盐浓度，采用Tris-HCl (pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+Eis,不存在 金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中 的EDTA更能稳苯酚、氯仿、异戊醇在DNA提取时的作用抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间 的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。

经过离心，变性蛋白质的密度比 水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下而，从而与溶解在水相中的DNA分开而 酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作 用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一泄程度的互溶，大约10%〜15%的水 溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯 仿与水不相混溶，不会带定DNAo所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好经酚 第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质， 此时一起将酚带走也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合(1:1)使用为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气 泡会阻止相互间的充分作用加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡 沫产生一般采用氯仿与异戊酵为24： 1之比也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25： 24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24： 1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助 于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳立。

苯酚：氯仿：异戊醇为什么要25:24:1?抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子, 当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去 水合状态而变性经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在 水相下而，从而与溶解在水相中的DNA分开而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下 层作为表而变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚 与水相有一泄程度的互溶，大约10%〜15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中 的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNAo所以在 抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚 与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走也可以在第二次抽提时, 将酚与氯仿混合（1:1）使用为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀， 必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用加入 异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。

一般采用氯仿与异戊酵为 24： 1之比也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25： 24:1 。