紫外吸收法测蛋白质含量.pdf

紫外吸收法测定蛋白质紫外吸收法测定蛋白质紫外吸收法测定蛋白质紫外吸收法测定蛋白质含量含量含量含量一一一一、、、、基本原理基本原理基本原理基本原理:•蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸残基，它们的结构中具有共轭双链，对紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波长处在此波长附近， 蛋白质溶液的光吸收值与其含量（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白质的定量测定但不同种的蛋白质对280nm波长的光吸收强度因芳香性氨基酸残基含量的不同而有差异，因此需用同种蛋白质作对照，结果才可靠在半定量测定和纯蛋白的定量测定时，可用280nm的光吸收法•基本原理基本原理基本原理基本原理此外，部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸、核苷酸和碱基等物质在紫外区也有强的光吸收，常与蛋白质类相互干扰但二者的紫外吸收特性不一样，由于核酸类物质在260nm有最大吸收值，因此，可利用蛋白质280nm和260nm的吸收差法来测定计算蛋白质浓度紫外吸收法操作简便快捷，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定，在蛋白质和酶的生化制备及其它研究中应用广泛，尤其是适合于柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。

二二二二、、、、试剂和器材试剂和器材试剂和器材试剂和器材1．标准蛋白质溶液：准确称结晶牛血清白蛋白，配制成浓度为1mg/ml的溶液2．待测蛋白质溶液：浓度为1mg/ml左右的蛋白质溶液3. 紫外分光光度计4.移液枪5.试管和试管架6.吸量管三三三三、、、、操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤（一）280nm的光吸收法（1）标准曲线的绘制: 取8支试管，编号后按下表加入试剂OD2801.00.750.6250.500.3750.250.1250蛋白质浓度（mg/ml）01.01.52.02.53.03.54蒸馏水4.03.02.52.01.51.00.50标准蛋白质溶液87654321号试剂(ml)取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，混匀，按上述方法测定280nm波长处的光密度值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度2)(2)(2)(2)样品测定样品测定样品测定样品测定(二二二二)280nm和和和和260nm的吸收差法的吸收差法的吸收差法的吸收差法将待测的蛋白质溶液稀释到光密度在0.2至2.0之间，在波长280nm和260nm处以相应的溶剂作空白对照，分别测得待测样品的光密度值（OD280和OD260）。

应用280nm和260nm的吸收差法经验公式直接计算出蛋白质浓度蛋白质浓度（mg/ml）=1.45OD280-0.74OD260。