鲍曼不动杆菌分子流行病学研究进展.doc

［摘要］介绍了鲍曼不动杆菌的分子流行病学 特征，并比较了鲍曼不动杆菌几种分子分型方法的优 缺点 ［关键词］鲍曼不动杆菌分子流行病学 分子分型 流行病学的研究对象是某种疾病在特定人群中发生、传播、预防、控制的影响 因素，暴发性感染及其病原微生物的研究是流行病学 研究的重要内容分子流行病学是流行病学的重要领 域，它的主要工作是通过追溯病原体来源，为判断暴 发性感染的范围、扑灭疫情、制订预防策略提供重要 依据上世纪80年代以来，DNA分子分型作为分子 流行病学的重要技术迅猛发展，并为流行性感染的预 防和控制提供了重要信息 1不动杆菌的分子流行病学 不动杆菌属(Acinetobacter)是需氧、不 发酵糖类的革兰氏阴性杆菌，可分为6种：醋酸钙不 动杆菌(A. calcoaceticus)> 鲁菲不动杆菌(A. Iwoffi)、鲍曼不动杆菌(A. baumanii)、溶血不动杆菌(A.haemolytius)、琼氏不动杆菌(A.junii)和约翰逊不动 杆菌(A. johnsonii) 不动杆菌是机会致病菌，鲍曼不动杆菌、不动杆菌属3型和13TU型是主要病 原菌，常引起重症监护病房患者的呼吸机相关性肺炎、皮肤和软组织感染、创面感染、泌尿系统感染、继发 性脑膜炎和败血症⑴。

鲍曼不动杆菌、不动杆菌属3 型和13TU型等临床相关菌株与环境菌株醋酸钙不动 杆菌具有高度相似的生化和遗传表型，在临床诊断实 验室常难以区分，因而被统称为醋酸钙-鲍曼不动杆菌 复合体 (A. calcoaceticus?A. baumannii complex, Acb complex) [2]0不动杆菌属3型、13TU型在临床上相 对少见，但这可能与VITEK等临床常用菌种鉴定系统 不能将其与鲍曼不动杆菌进行鉴别有关醋酸钙不动 杆菌是环境菌株，而非临床致病株；其他不动杆菌也 少见于临床样本，一般认为毒性较低约翰逊不动杆 菌(A.johnsonii)、琼氏不动杆菌(A.junii)、鲁菲不动 杆菌(A.lwoffii)等偶可引起散发医院内感染，多与 有创性置管治疗有关且大多预后较好⑶ 与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)等广泛传播病原菌 的流行病学特征相似，鲍曼不动杆菌的流行病学特征 包括：单克隆传播倾向、常引起医院获得性感染、多 具有多重耐药特征鲍曼不动杆菌常引起区域性暴发 性院内感染[4-7]o其在医院内传播的主要途径是：接 触被污染的医疗环境；接触未做好安全防护的医护人 员鲍曼不动杆菌感染的危险因素亦与其他多重耐药 病原菌相似⑻。

宿主因素为：重大手术、包括烧伤在 内的严重创伤、早产儿暴露因素包括：居住重症监 护病房、住院时间、居住鲍曼不动杆菌曾经流行的病 房、接触被污染的医疗设备治疗相关因素包括：机 械通气；静脉置管、尿路置管、体腔引流等置管相关治疗；多次有创操作和抗生素治疗史 目前医院 暴发性感染常发生于重症监护病房，而鲍曼不动杆菌 是主要病原体，而重症监护病房大量使用的抗生素起 到了对多重耐药菌株的选择作用近年来临床分离鲍 曼杆菌的多重耐药率逐年稳步上升，且近年来碳青霉 烯类抗生素的耐药率也明显提高，部分菌株甚至对多 粘菌素、替佳环素等不常用或新开发抗生素也产生了 明显耐药性[lz 9-11]o现有研究证明，鲍曼不动杆菌的 多重耐药菌株和抗生素敏感菌株在耐干燥和耐消毒剂、 生物被膜、人类细胞黏附能力方面并无明显区别，因 而多重耐药可能是流行克隆的主要特征[12-14] o 细菌克隆是指分离自不同时期不同地区，但具有相同 的生物特征，因而可能来自同一祖先的菌株在漫长 的传播过程中，同一细菌克隆可能衍生出具有细微生 物特征差别的亚克隆基于扩增片段长度多态性(AFLP) 和脉冲场凝胶电泳(PFGE)的分子分型技术研究结果 都提示：与其他广泛流行的病原菌类似，鲍曼不动杆 菌在不同国家的暴发性流行都由有限的几个克隆引发,而非大量克隆的同时播散［5-20］。

基于细胞封套蛋白谱、 核糖体分型和AFLP指纹的研究首次证实了欧洲1型和 2型克隆的存在［4］此后不久，欧洲3型克隆亦被报 逾7］目前已知以上3个克隆的流行区域不仅限于欧 洲，而是在世界范围内广泛传播，其流行区域也包括 亚洲和中国［21］o 2鲍曼不动杆菌的常见分型方 法 1986年，Bouvet等建立了基于菌株生化表型 的不动杆菌分类系统［22］o随后，Gerner-Smidt等于 1991年将该系统进行了进一步简化，使其更加实用［2］ 此后发展起来的多种基于遗传表型的分型方法可更准 确地对不动杆菌进行鉴定目前为止，不动杆菌属可 分为33型，其中17型已得到正式命名 目前可用于不动杆菌分子分型的技术有核糖体基因分型、 AFLP、PFGE、MLST等，其中核糖体基因分型、AFLP、 PCR/ESI-MS还能用于菌属鉴定现分述如下： 2.1质粒分析大部分不动杆菌都含有质粒，其中部分与 耐药性及耐重金属杀灭作用有关［23-26］o质粒分析是 最早应用于鲍曼不动杆菌分子分型的技术［27-29］,目 前亦成功应用于其他不动杆菌的分子分型［30-32］o但 该技术的缺陷也很明显：质粒易于在菌株之间传递， 因而该分型方法的可靠性有限。

2.2核糖体基因分型核糖体基因分型可用于不动杆菌菌属鉴定，尤 其是醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体的菌属鉴定[33-35] o 早先使用EcoRK ClaL Sall等限制性内切酶的核糖体分型技术操作繁琐，且精确度低于PFGE[36Z 37]o后来 开发的使用Hindlll/Hincll等限制性内切酶的核糖体分 型技术，其精确度已与AFLP相当近来出现的自动核 糖体基因分型仪的精确度类似于PFGE且耗时少；但 自动技术花费较大，只有少数研究机构才有能力购置[37-39]o 2.3脉冲场凝胶电泳PFGE目前仍是大 部分菌属的标准分子分型技术，小样本的研究也显示PFGE和AFLP的精确度相似[7, 37]；但该方法操作繁琐 且耗时较长，无法大量推广 2.4 AFLPo可同时应用于不动杆菌的菌属鉴定和分子分型[4, 40, 41]o AFLP目前已成功应用于鲍曼不动杆菌暴发性感染的 分子流行病学研究⑺15, 16, 42],并最早推断出欧洲I、 IMII型3个流行克隆的存在⑺34, 43] -2000年，Leiden 大学医学中心建立了包括2000多株菌株的AFLP数据 库，为AFLP的进一步推广打下了基础。

但该方法对技 术的要求较高，在分析条带型时也需要大量的经验， 因而只适用于少数大型研究机构此外该方法的一个 重要缺陷是重复性受外界因素的影响较大，不同实验 室之间的研究结果无法比较 2.5 MLSTo MLST是一种通过对多个管家基因的部分DNA序列测序来 发现菌株变异的分型方法MLST 一般测定7个管家基 因内部的部分DNA序列，根据每一序列的序列特异性 赋予一个特定的等位基因编号，每一菌株7个管家基 因的7个特异性编号即构成该菌株的序列型(sequence type, ST)0 MLST 的分辨力接近于 PFGE 和 AFLP,并已成功应用于多种菌属[44-47],但花费较大 且操作繁琐，不适用于鲍曼不动杆菌暴发性感染的临 床检测该方法的明显优势在于可比较不同来源菌株 的亲缘关系并用于分子流行病学的研究目前已有多 种MLST分型技术应用于鲍曼不动杆菌的研究[48-51], 但这些技术因为未能结合鲍曼不动杆菌特有的遗传结 构，因而仍然无法揭示流行克隆的内在遗传特征2.6 PCR/ESI-MSo可用于不动杆菌的菌属鉴定，也可将 鲍曼不动杆菌、不动杆菌3型、13Tu型区别开来[48]o 该方法的优点是实验时间短，4小时即可。

但其可靠 性还有待进一步分析 综上所述，质粒分析分型可靠性差，核糖体基因分型分辨率较低；而AFLP、PFGE 等指纹分型技术只能提供有限的遗传进化信息、各实 验室使用的操作规程及阈值存在差异、实验室之间的 结果无法比较、无法排除菌株亚型的干扰，因而在分 子流行病方面的应用有限现有的多种鲍曼不动杆菌 MLST分型技术亦无法揭示流行克隆的遗传特征3基于最小生成树分析的MLST分型技术 目前已 知发生于世界不同地区的鲍曼不动杆菌暴发性感染与 都与欧洲1型、2型和3型克隆有关，但对其他不动 杆菌的遗传差异及进化相关性却知之甚少2010年4 月，法国巴斯德研究所为主导的多个团队，共同建立 了一个鲍曼不动杆菌MLST分型系统，试图解决这一 难题［52］该研究搜集了遗传背景尽可能多样化的不 动杆菌属菌株作为研究对象，其中最主要的是123株 AFLP指纹谱完全不同的临床分离菌株(含48株医院 暴发性感染相关菌株)此外还包括15株与鲍曼不动 杆菌遗传表型高度相似的不动杆菌属3型、13TU型、 醋酸钙不动杆菌和4株其他不动杆菌属菌株于最小生成树分析(Minimum spanning tree analysis) 的MLST分型系统的分析表明：鲍曼不动杆菌的进化 与其他广泛播散的感染性病原菌的树形进化不同，表 现为菌株之间遗传差异相对较小的星形进化，这可能 与鲍曼不动杆菌近期进化过程中曾经存在一个比较严 重的进化瓶颈有关。

同时，鲍曼不动杆菌与醋酸钙- 鲍曼不动杆菌复合体其他菌株，也并非如此前所知的 那样具有高度的遗传表型相似性，而是存在较明显的 遗传差异目前该MLST系统已可成功地对欧洲1型、2型和3型三个已知流行克隆进行鉴定，并可用于描述鲍曼不动杆菌菌株之间的亲缘关系 这一MLST分型系统目前报道了 5个克隆复合体，其中克隆 复合体1、2和3分别对应欧洲1、2和3型克隆［52］1型克隆复合体又包含了 1、7、8、19和20型共5个 序列型其中序列7、8、19和20型相互之间各存在2个核昔酸的序列差异，但与序列1型却都仅有一个核昔酸的序列差异，因而序列1型被认为是1型克隆 复合体的遗传起源，而其他各序列型都是由序列1型 进化而来2型克隆复合体包含2、45和47共3个序 列型序列45和47型与序列2型在管家基因fusA上 存在序列差异，因而序列2型是2型克隆复合体的遗 传起源3型克隆复合体则包含序列3和14型AFLP、PFGE等分型技术目前已广泛应用于多种病原菌 的分子流行学研究［15-20］,但这些指纹谱分型技术提 供的遗传信息过于庞杂，无法排除流行克隆菌株在播 散过程中产生的克隆亚型的干扰，因而提供的信息有 限。

该研究表明：这一 MLST分型系统与AFLP相似性 80%为分型界值的敏感性相似，而较相似性90%为界 值的AFLP分型方法敏感性更低［52］o因而该分型方法 在准确鉴定鲍曼不动杆菌克隆特异性的同时，还可避 免遗传指纹谱分型方法因敏感性过高而将克隆亚型错 误鉴定为克隆型的缺陷 综上所述，分子流行病学的主要研究内容是鉴定不同暴发性感染的病原菌是 否来自同一克隆，分子分型技术可用于追溯不同医院、 不同城市、不同国家、甚至不同大陆暴发性感染的来 源，包括MLST在内的新型分子分型技术的出现，将 为研究多重耐药鲍曼不动杆菌的流行机制提供重要的 依据 参考文献： ⑴Dijkshoorn L,Nemec A, Seifert H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii[J]. Nat Rev Microbiol, 2007(5): 939-951. [2] Gerner-Smidt P,Tjernberg I, Ursing J. Reliability of phenotypic tests for identification of Acinetobacter species[J]・ J Clin Microbiol, 1991(29): 277。