花椒再生体系的建立及ipt基因遗传转化研究.pdf

曾晓芳花椒再生体系建立及弘基因遗传转化研究中文摘要本研究以朝仓花椒为研究对象，建立组培再生体系，并在此基础上，首次利用农杆菌介导法将细胞分裂素生物合成限速酶一异戊烯基转移酶基因( i p t ) 导入花椒体内，探索花椒遗传转化的技术参数，初步建立了花椒遗传转化体系，为利用基因工程技术对花椒进行遗传改良打下基础其主要研究内容如下：l 花椒再生体系建立试验以花椒萌发生长5 ．2 0 d 的无菌苗叶柄、茎段及叶片为外植体，研究在以W P M 培养基为基本培养基中附加不同的浓度的细胞分裂索( 6 - B A ) 和生长素( N A A 、m A ) ，对朝仓花椒愈伤组织诱导及再生的影响，建立了朝仓花椒植株再生体系结果表明：愈伤组织诱导及分化最适培养基为W P M + 6 - B A 0 ．5m g ·L ．1 + N A A 0 ．2m g ·L ．1 ，最适生根培养基为I ／2 W P M 不添加任何激素，移栽时，以珍珠岩和田土l ：3 比例成活率最高，2 8 d 后统计成活率可达8 5 ．6 ％．2 农杆菌介导的朝仓花椒遗传转化体系建立．建立了以朝仓花椒叶柄及茎段为转化受体的根癌农杆菌遗传转化体系，初步确定了抗生素卡那霉素( k a n ) 的筛选浓度，在遗传转化过程中，详细探讨了外植体预培养时间、浸染菌液浓度、浸染时间、共培养时间等影响因素对转化效率的影响。

结果表明：外植体预培养3 d ，菌液浓度在O D 值0 ．5 - 0 ．7 ，浸染1 0 m i n ，共培养3 d 为最佳技术参数；延迟7 d 筛选可提高转化效率，重悬液及共培养基中添加1 0 0 脚n o l ·L ．1 A S 可提高转化率至2 4 ．6 ％3 转化植株检测通过农杆菌介导法遗传转化朝仓花椒，并对转化植株进行G U S 组织活性及P E R 检测结果表明部分转化植株G U S 染色显蓝色，部分植株P C R 检测呈阳性，初步证实目的基因已转入花椒基因组中f p f 基因表达有效促进了朝仓花椒遗传转化过程中不定芽的诱导，转枷基因花椒能产生大量分枝，易于增殖培养，但转基因植株生根受到抑制关键诃：朝仓花椒；组织培养；再生；农杆菌；遗传转化4贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生毕业论文A b s t r a c tI nt h i ss t u d y , a ne f f i c i e n t p l a n tr e g e n e r a t i o np r o t o c o li nv i t r oa n dt r a n s f o r m a t i o nw i t h ／p tg e n em e d i a t e dv i a A g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sm e t h o do f Z a n t h o x y l u mp i p e r i t u m1 3 ( 2v a Li n e r m eM a k i n ow e r ea c h i e v e df i r s t l y ．T h ee s t a b l i s h m e n to fe f f i c i e n tr e g e n e r a t i o ns y s t e ma n dA g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s - m e d i a t- e dt r a n s f o r m a t i o no f Z a n t h o x y l u mp i p e r i t u mD Cv a r ．i n e r m eM a k i n ow i l lm a k es u b s t a n t i a lc o n t r i b u t i o na sa ne s s e n t i a la n du s e f u lm e a n st of u r t h e rf u n d a m e n t a ls t u d yo f b r e e d i n gb yt h ea p p l i c a t i o no f g e n e t i ce n g i n e e r i n gt e c h n o l o g y ．1 ．E s t a b l i s h m e n to fh i g he f f i c i e n tr e g e n e r a t i o ns y s t e mo fZ a n t h o x y l u mp i p e r i t u mD Cv a r ．i n e r m eM a k i n oI nt h i ss t u d y , t h ee x p l a n t s0 c a v ep e t i o l e sa n ds t e m s ) w e r ec u l t u r e di n v i t r oo nW P Mm e d i u ms u p p l a n t e dw i t hN - 6 b e n z y l a d e n i n e ( 6 ·B A ) ，a - n a p h t h a l e n e a c e t i ca c i d ( N ．从) a n di n d o l e - 3 - b u t y r i ca c i d( m A ) ，a n de s t a b l i s h e dt h ep l a n tr e g e n e r a t i o ns y s t e mo fZ a n t h o x y l u mp i p e r i t u mD Cv a t ．i n e r m eM a k i n o ．T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em o s ts u i t a b l ec u l t u r em e d i u mf o rc a l l u si n d u c t i o na n ds h o o t sr e p r o d u c t i o nw a sW P M + 6 - B A 0 ．5m g ·L ．1 + N A A 0 ．2m g ·L ．1 ．I n d u c t i o no fr o o t i n gW a sa c h i e v e db yt r a n s f e r r i n gt h es h o o t st ot h eh a l fs t r e n g t hm a c r o - e l e m e n tW P Mm e d i u m ．T h ep l a n t l e t sw e 旭t r a n s p l a n t e dt os o i la f t e ra c c l i m a t i z a t i o n ．2 ．E s t a b l i s h m e n tt h eG e n t e t i ct r a n s f o r m a t i o nS y s t e mo fZ a n t h o x y l u mp i p e r i t u mD Cv a t ．i n e r m eM a k i n om e d i a t e dv i aA g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sT h eg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo fZ a n t h o x y l u mp i p e r i t u mD C 髓／n e r m eM a k i n ow a so p t i m i z e db yu s i n gt h ec o t y l e d o na n dh y p o c o t y la st h er e c e p t o r sm e d i a t e dw i t hA g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ．T h ec o n t e n to fk a n a m y c I nO C a n ) s e l e c t i o np r e s s u r e sw e l ' ed e t e r m i n e da s3 0m g - L “ ‘f o rs h o o tr e g e n e r a t i o no fp e t i o l e sa n ds t e m s ．T om o n i t o rt h ei n d u c t i o nr a t eo fK a n a m y c i n - r e s i s t a n tc a l l u s , t h eo p t i m a lp a r a m e t e r s( s u c h 嬲p r e - c u i t u r et i m e , b a c t e r i u mc o n c e n w a i o n , i n f e c t i o nt i m e , c o - c u l t u r et i m e ．) f ．o rA ．t u m e f a c i e n s - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o no fZp i p e r i t u mD Cv a r ．／n e r n m eM a k i n ow e r ee x a m i n e d ．T h er e s u l t ss h o w e dt h a t3d a y s ’p r o - c u l t u r e ，1 0m i l lA g r o b a c t e d u m ( o D 鲫a b o u t0 ．5 - 0 ．7 ) i n f e c t i o nw i t h1 0 0 P m o l ·L ．1a c e t o s y r i n g o n e ( A S ) ，a n d3d a y s ’c o - c u l t u r ew o u l dl e a d t oa ni n c r e a s ei nt r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c y ．3D e t e c t i o no ft r a n s g e n i cZ ．p i p e r i t u mD Cv a r ．i n e r m eM a k i n op l a n t sT h eb i n a r ye x p r e s s i o ne l e m e n tw i t h 枷g e n ei st r a n s f o r m e dt oZ p i p e r i t u mD Cv a t ．i n e r m eM a k i n ov i aA g r o b a c t e d u mm e d i a t e dm e t h o d ．T h er e s u l t ss h o w e dt h a tm a n yt r a n s f o r m a n t ss h o w e db l u ew h e nt h e yw e r ed y e da n dm a n ya l s os h o w e dp o s i t i v ew i t hP C Rc h e c k i n g ．A l lo ft h e s er e s u l t sp r o v et h a ta i m e dg e n eS曾晓芳花椒再生体系建立及枷基因遗传转化研究 。

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