实验三+培养基的制备及灭菌.ppt

实验三 培养基的制备及灭菌一 、实验目的1、了解培养基制备原理，学习并掌握培养 基制备方法 2、掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的原理和方法 二、基本原理（一）培养基的制备原理v培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混 合养料v从营养角度分析： ♪营养：碳源、氮源、能源、生长素、水分 和无机盐等； ♪适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力； ♪一定的氧化还原电位； ♪合适的渗透压u 琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固，不容易被微生物污染但多次反复融化，其凝固性降低二）灭菌原理u1 干热灭菌原理干热是指相对湿度在20％以下的高热干热消毒灭菌是由空气导热，传热效果较慢一般繁殖体在干热80－100℃中经1小时可以杀死，芽孢需160－170℃经2小时方可杀死u2 湿热灭菌原理－高压蒸汽灭菌在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢三、实验器材1、药品 琼脂，10％HCL，10% NaOH，牛肉膏蛋白 胨培养基的配方药品。

2、材料具刻度1000mL塘瓷量杯，天平，试管，量筒 ，小烧杯，玻璃棒，药匙，pH试纸，棉花， 报纸，麻绳，标签，培养皿等 3、设备高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等四、实验方法及步骤（一）培养基的制备 u1、称量u2、溶解u3、调调pHu4、过滤过滤u5、分装u6、加塞u7、包装u8、灭灭菌u牛肉膏 3gu蛋白胨胨 10guNaCl 5gu琼琼脂 20gu水 1000mlupH 7.0~7.2 u121oC 灭灭菌20min牛肉膏蛋白胨培养基制备步骤：马铃马铃马铃马铃薯薯(PDA)(PDA)培培养养基培基培养养( (霉菌用霉菌用) )制制备备备备马铃马铃马铃马铃薯薯 200g200g 蒸蒸馏馏馏馏水水 1000mL1000mL蔗糖蔗糖 20.0g20.0g pHpH 自然自然琼琼琼琼脂脂 20.0g20.0g• •马铃马铃马铃马铃薯汁制薯汁制备备备备：：将将马铃马铃马铃马铃薯去皮，薯去皮，称称量所量所 需重量，切成小需重量，切成小块块块块, ,加水煮沸加水煮沸30min.30min.• •调节调节调节调节pHpH值值值值(4)(4)过滤过滤过滤过滤 用用滤纸滤纸滤纸滤纸或或双双层纱层纱层纱层纱布布( (中中间夹间夹间夹间夹一一层层层层脱脱脂棉花脂棉花) )趁趁热过滤热过滤热过滤热过滤。

3)(3)在滤滤液中加入琼琼脂，煮沸溶解后加糖（用于培养霉菌的加入蔗糖，用于培养酵母菌的加入葡萄糖），补补足水分，分装5)(5)分装分装 根据不同的需要，可根据不同的需要，可将将制好的培制好的培养养基分装基分装入入试试试试管或三角管或三角烧烧烧烧瓶内瓶内, ,包扎管包扎管( (瓶瓶) )口斜面的摆法斜面的摆法注意事项！u（1）在制备固体培养基加热融化琼脂时要不断搅 拌，避免琼脂糊底烧焦u（2）液体培养基：分装高度以试管的1/4左右为宜u（3）固体培养基：分装试管，其装量为管高的1/6~1/5灭菌后制成斜面分装三角瓶容量以一半为宜u（4）半固体培养基：分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂u（5）不要使培养基沾在管口或瓶口，如沾上，需用干净的纱布擦干净二）灭菌 干热灭菌操作步骤：u（1）在移液管尾部塞上少许棉花，然后用报纸条包好；用报纸条包好干燥的培养皿u（2）将待灭菌物品包扎好，均匀放入烘箱内，注意不要摆的太挤，以免妨碍气流流通u（3）开启电源，设定温度为160oC~170oC，保 持此温度1~2小时u（4）切断电源，待温度降至70oC以下时，打 开箱门，取出灭菌物品。

湿热灭菌湿热灭热灭菌操作步骤骤： 1、灭菌物准备 （1） 培养基准备 （2） 无菌水的准备用100ml量筒量取90ml的自来水装入 250ml的带玻璃珠的三角瓶中，做好棉塞， 用牛皮纸包好2、高压蒸汽灭菌（1）加水：♫ 将高压蒸汽灭菌锅的内桶取出，向外锅内加 入适量的水，将内桶放入手提式锅） ♫ 直接加水至锅内底部隔板以下1/3处有加水 口者由加水口加入至止水线处立式锅） （2）装锅：把需灭菌的器物放入锅内，关严锅盖3）接通热源：打开排气阀，待见有大量水汽排出时 ，维持3～5min，锅内空气排尽，关上排 气阀 （手提式锅）先将锅盖上排气阀关闭，同时打开底 部排气阀待见有大量水汽排出时，维持 3～5min，关上底部排气阀立式锅）（4）升压、升温：关闭排气阀以后，锅内成为密闭系统，蒸汽不 断增多，压力计和温度计的指针上升，当压力达 到 1.05 kg/cm2（温度为 121℃）即灭菌开始，这 时维持在1.05 kg/cm2，20～30min除含糖培养基用0.56 kg/cm2压力外，一般都用 1.05 kg/cm2压力5）切断电源：达到灭菌时间要求后停止加热，任其 自然降压，当指针回到0时，打开排气阀。

6）揭开锅盖，取出灭菌物，排掉锅内剩余水7）待培养基冷却后置于37℃恒温箱内培 养24 h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用注意事项！u（1）灭菌物不要装得太满，否则灭菌 不彻底u（2）盖上锅盖，以两两对称方式同时旋 紧螺栓，勿使漏气u（3）排气阀不能过早打开，否则培养基因压力突降，温度没下降会使培养基翻腾冲到 棉塞处，既损失培养基又沾污了棉塞牛肉膏蛋白胨培养基配制任务：u 100~150ml/250ml三角瓶.（4瓶/组组）灭灭菌任务务与完成步骤骤：1、装有玻璃珠的三角瓶装入90ml自来水1瓶/组组 2、培养基平均分装入三角瓶中 4瓶/组组 3、湿热灭热灭菌 4、包移液管 2支/人 5、包培养皿 2皿/人 6、干热灭热灭菌五 思考题及作业题u1、培养微生物的培养基应应具备备哪些条件？u2、 为为什么培养基配制好后必须须立即灭灭菌？u3、 在培养基中，琼琼脂有何作用？它有哪些特性？u4、 使用高压压蒸汽灭灭菌锅灭锅灭菌时应时应注意哪些事项项？u5、 为为什么干热灭热灭菌比湿热灭热灭菌所需要地温度高，时间长时间长？请设计请设计干热灭热灭菌和湿热灭热灭菌效果比较实验较实验方案。