小鼠破骨细胞分离培养及鉴定.docx

小鼠破骨细胞分离培养及鉴定骨疾病的发生与骨形成、 骨吸收失衡有关， 骨吸收大于骨形 成 导致骨量减少， 而骨吸收又与破骨细胞的数量和功能有关 [1] 从破 骨细胞着手揭示骨吸收机制， 为许多由破骨细胞引起的疾病 如绝经后 的骨质疏松、风湿性关节炎、牙周病、肿瘤相关性骨溶 解以及矫形外科 中的植入体的丢失等提供防治依据与此相关， 分离成熟的破骨细胞对 于研究破骨细胞的特征、 功能和调节来说 显然是一种必不可缺少的工 具 该研究以小鼠为试验对象， 建立 小鼠共培养试验培养破骨细胞的 方法， 来获得具有特征性的破骨 细胞1 材料与方法1.1 试验材料抗酒石酸酸性 磷酸酶1.1.1试验动物日龄MF1小鼠，由扬州大学比较医学中心提供1.1.2 主要试剂及仪器 a -MEM 胎牛血清，(TRAP染色试剂盒、1, 25- (OH 2D3,甲苯胺蓝，直径5 mm的象牙片YJ2875B型医用净化工作台，PS29000705超纯水装置，24孔培养板，二氧化碳培养箱， 超声清洗仪， XSZ-D2 倒置显微镜， XL30-ESEM 环 境扫描电子显微镜[2 - 3] 1.2 试验方法1.2.1 成骨细胞分离培养。

将 1 日龄的小鼠浸入 75%酒精浸 泡 35 min无菌剪取其头盖骨，去除表面结缔组织和毛细血管，放入50 mL 离心管，加入 3 mL 0.25%胰蛋白酶，37 C 气浴 摇床消化 20 min , 80 r/min,弃胰酶用PBS冲洗并尽量吹打 以除去成纤维细胞将骨片剪 成糊状，加入0.1%H型胶原酶3 mL置气浴恒温振荡器内80 r/min、37 C振荡消化1 h[2-3]将头盖骨转入1.5 mL指形管中，用剪刀剪碎， 直至剪成糊状（需时 30 min ），混匀转入 50 mL 离心管，封口， 37 C 气浴摇床消化60 min , 80 r/min ;转入离心管用 PBS 洗涤然后转入 15 mL 离心 管， 离心 10 min , 1 500 r/min 弃去上清，再反复用 PBS 吹打 洗涤离心 2次，1 000 r/min , 5 min弃去上清，沉淀即为成骨细胞（0B,加入 3 mL 完全 D-MEM 重悬，吹打均匀，再加入 3 mL 完全 D-MEMt 悬，吹 打均匀静置 20 s 后取上悬液接种于培养瓶 中， 37 C、 5% CO2 饱和湿 度下培养 24 h 后换液，以去除骨碎 片和未贴壁的组织块、细胞。

之后 每隔 48 h 换液 1 次， 5 7 d 后生长良好1.2.2 骨髓细胞分离参阅国内外文献 [4-6] ，分离 3 只 3 月龄 大的小鼠的胫骨和股骨，取 25 号针头，用 HBSS+10 胎牛血 清将骨髓 吹出 先用 19 号针， 再用 25 号针将细胞吹碎得到细胞 悬液通过 ficoll将红细胞移去（600 g, 25 min，刹闸关闭），收取细胞后用HBSS 青洗 1 遍，用 1 mL 培养基悬浮细胞保持细胞 在冰上1.2.3 共培养操作 每一板中骨髓细胞的数量和成骨细胞的 最适数量是不同的 这个最适数量要考虑小鼠的品种， 例如采用 的是 MF1 小鼠，则其破骨细胞最适的密度为： 在 96 孔培养板中， 每孔添加 100 卩 L 培养基+10 nmol/L VD3+8 x 103 成骨细胞，为 防止 溶液的蒸发，边孔不添加细胞，但应填满水在第 1 天，每 个孔添加 50 卩 L 2X 105 个新鲜分离的骨髓细胞，培养基中应该 含有 10 nmol/LVD3在第6天，重新换50%新鲜的培养基，方法如下：①每孔添加 150卩L含有20 nmol/L VD3的新鲜培养基；②让细胞沉降15 min :③ 然后每孔再移掉150卩L。

在第10天的时候，进行固定和染色重新 换液需要非常谨慎，因为成骨细 胞层很容易受到干扰，脱落，这会导致 破骨细胞数量的减少通 常情况下， 出现第 1 个破骨细胞一般在第 6 天，适量的破骨细胞 的出现一般在第 7〜10 天1.2.4 TRAP 染色取培养 24 h 的玻片，置于 2.5%戊二醛中 在 4C条件下固定10 min,用蒸馏水冲洗干净后，浸入孵育液中，在37 C条件下避光水浴1 h，然后置于光镜下进行细致观察[2-3]1.2.5 破骨细胞形态学观察倒置显微镜观察细胞的形态、 生长 及贴壁情况1.2.6 破骨细胞的骨吸收第二阶段培养时加入 a -MEM 培养， 3〜4 d 后将象牙片取出，用 PBS 冲洗，置于 0.25 mol/L 氢 氧化铵 溶液中超声处理3次（5 min/次），去除附着细胞，暴露吸收陷窝然 后用梯度乙醇脱水，多聚甲醛固定， CO2 临界点干 燥，离子喷镀仪喷镀镀金，扫描电镜摄片 [2-3] 2 结果与分析2.1 破骨细胞的一般生物学特性在共培养 6 d 后能观察到破骨细胞，细胞生长快， 2 h 已基 本贴壁，且紧密度较高主要为体积较小的类圆形和不规则形， 一般 1 〜2个核，极少数有3个核，有伪足。

破骨细胞难以用胰 蛋白酶-EDTA进 行消化，且随着细胞代数增加，消化难度加大消化前用PBS清洗1遍，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1 min,轻轻吹打，将部分脱落的细胞移去，然后用 PBS 浸泡数分钟，用 胰蛋白 酶继续消化，如此反复可消化大部分细胞 [2-3] 2.2 破骨细胞的一般形态观察共培养 7 d 后，观察到细胞贴壁生长， 体积较大， 增殖旺盛， 呈 油煎蛋形、长条形或不规则形等，有伪足和丝状突起未染色 前细胞边 缘模糊，胞内的核很难与其中的杂质细胞进行区分 [2-3] 培养细胞中 混有大量骨髓基质细胞和红细胞，破骨细胞 较少（图 1 ） 2.3 破骨细胞的 TRAP 染色结果共培养 8 d 后，置于倒置显微镜下观察， TRAP 阳性破骨细胞质中含有大量酒红色颗粒，细胞核阴性， 细胞大小不一， 有 2〜 50个核，甚至更多，以 10 多个核的细胞居多核积聚在细胞中 央， TRAP染色后，破骨细胞形态清晰（图 2）,呈油煎蛋形，或 哑铃状，很容易 辨别2.4 破骨细胞象牙片吸收陷窝观测结果扫描电镜观察结果显示，未加破骨细胞象牙片（图 3）表面较光滑，无吸收陷窝生成加破骨细胞象牙片（图 4）观察到的吸收陷窝立体感强，陷窝底部纤维纹路清晰，骨组织被侵蚀、溶 解，形 成明显的吸收陷窝，陷窝呈蜂窝状、圆形、椭圆形、腊肠 形等多种形态， 边界清楚。

3 讨论 破骨细胞是一种多核巨细胞，是唯一产生骨吸收的细胞类型 Chambers et al[7] 建立的破骨细胞体外培养技术为破骨细 胞体外 培养奠定了基础 截至目前， 已可以从多种动物四肢长骨 分离成熟破 骨细胞，如新生大鼠和小鼠、新生兔、鸡胚，甚至引产胎儿的长骨破 骨细胞的鉴定方法： 一是细胞的形态特点有多 核、伪足运动活跃 [8] ； 二是抗酒石酸酸性磷酸酶强阳性；三是 含有降钙素受体；四是与骨片共 同培养，可以形成骨吸收陷窝 破骨细胞能分泌抗酒石酸酸性磷酸酶，TRAP 染色呈阳性破骨细胞可在象牙片上或骨片上形成骨吸收陷窝， 陷窝成圆形、 椭圆 形或 不规则形，边界清晰 [2-3] 用小鼠共培养操作诱导获得具有特征性的破骨细胞 运用倒 置相差显微镜、TRAP染色和骨吸收陷窝来鉴定培养的破骨细胞，从结果中 发现， 在倒置相差显微镜下未染色前破骨细胞边缘很不 清晰，破骨细 胞胞内的核很难与视野中的杂质细胞如红细胞和骨 髓细胞相区分 100倍显微镜下破骨细胞数量比较少，而且混有 大量骨髓基质细胞和红细胞 用 TRAP 染色鉴定，能够很清晰地 找到破骨细胞，破骨细胞呈油煎蛋 形、长条形或不规则形等。

图 片中破骨细胞有大有小， 这是因为破骨 细胞是通过多个核融合形 成的，因此当融合的核数量多时，破骨细胞也 就比较大在培养 过程中也发现破骨细胞数量偏少， 这与利用兔、 鸡 等动物分离的 破骨细胞得出了相同结论在扫描电镜 4 000 倍下观察 象牙片上 的骨吸收陷窝，很容易发现破骨细胞的特征性功能——骨吸收 而且发现骨吸收陷窝有大有小， 有浅有深， 这与培养的破骨细胞 的活 性以及大小有着密切的关系 [9] ，当然这需要进一步的研究 证明。