简单的方法制备超级感受态.docx

目的该文件用于说明用于质粒转化的感受态细胞的制备，确保其使用方便，并能 够指导具体工作一、 范围感受态细胞是理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA 的生理状态，适合用于将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可 以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿 主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作二、 程序1试剂和材料器材1冰浴2离心机3 37度恒温培养箱4摇床5分光光度计6酒精灯7小培养皿8 枪(1000111 100111)9玻璃试管10 1.51111 EP 管11冻存盒12 501111离心管材料与试剂1液体LB培养基2液体SOC培养基3固体LB培养基4 O.lmoL L Cacb5 0. ImoL L Mgcl：6冻存液(保存4度)2 操作程序注意该步骤是按200ml Soc的用量举例说明的，可做成lOOul/支,共40支感受态的量如需制备更多，按比例配置各溶液即可1取保存的大肠杆菌菌种，在无抗性LB固体培养基划线，37度培养过夜2取过夜培养的培养基，挑取单克隆于装有5ml LB的试管中，置于37度摇床，转速＞220rpnL 过夜3第二天将试管中的菌转至200nil SOC中，将SOC置于37度，200ipm的摇床中约2.3h（即菌液在60011111的波长下吸光值=03-0.4）4将菌液分装到50ml离心管中：冰浴10mm后3000ipm 4度 离心10mm5弃上清，取出在4度保存的501111 Mgch重悬沉淀（用枪头吹打要轻柔，不宜激烈），最后 将沉淀平均分装到两个50ml离心管中，（注意冰上操作）：冰浴3-5imn.3000ipm 4度 离心 lOnmi6弃上清，取出在4度保存的1 OOmlCacL,先取10ml的Cack将两管中的沉淀悬浮均匀，再 将剩余的90ml,平分到两管中，混合均匀，冰浴时间〉20min; 3000ipm 4度离心10mm7弃上清，用4nil的冻存液将沉淀悬浮均匀后分装到1.51111EP管中（这步操作在超净台进行, 冰上操作，分装的量为lOOuU管）8分装后的感受态保存于-70度冰箱。

注意事项1操作过程尽量在冰上操作2操作过程要无菌操做3所需的EP管在实验前冻存于-20度冰箱4制备完成的感受态，冻存于-70度冰箱使用时，取出解冻后，就不能再次冻存使用5操作的前两步各需一天时间，开始制备过程需要4小时左右附录（试剂配制）除Soc是一升配方外，其它试剂均为做40支感受态所需用量O.lmol/L Cacl2=l.1102g Cach 溶解到 100ml ddH2o0.2mol'LMgcl2= 1.0169g Mgcl： hzo 溶解到 50nil ddH：o液体SOC配方：（20g 胰白腺 + 5g 酵母抽提粉 +0.5g Nacl +2.5ml Imolkclj.LddHzO冻存液0.6ml 甘油 +3.4inl Cacl?（0.Imol/L）。