四君子汤对FCIR 大鼠大脑皮质神经保护作用的实验讨论.doc

四君子汤对FCIR 大鼠大脑皮质神经保护作用的实验讨论=“news_bd”> 　　脑缺血损伤过程中， 细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)在酶解作用下降解，导致细胞间信号传递失调，从而造成神经元损伤、凋亡ECM 是构成血脑屏障的主要成分，也是神经元赖以生存的外环境和载体，能稳定神经系统内环境学，与中医学脾土的功能相似，ECM 的功能当属中医学脾土功能的范畴，因此刘旺华等提出健脾补土法治疗脑缺血的理论　　血管细胞外基质成分的合成和降解在正常生理情况下保持着动态平衡, 基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases, MMPs)参与了所有ECM 成分的调节，能够降解ECM 的大部分成分脑缺血过程中， 微血管基底膜的损伤导致层粘连蛋白(laminin，LN) 表达减少，与纤溶酶原激活系变化有关; 组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitorof matrix metalloproteinases，TIMPs) 是MMPs 的特异性内源性抑制剂， 可阻断MMPs 与底物的结合，防止ECM 降解，TIMP1 为其家族主要成员之一ECM 的降解可以破坏脑微血管结构的完整性，同时损坏血脑屏障，导致继发性脑水肿以及脑损伤。

研究发现，健脾补土法组方能减少神经元凋亡对于脑卒中后遗症， 其机制可能是通过抑制MMP9 表达以及LN 降解本研究从LN、TIMP1 和MMP9 蛋白的表达探讨健脾补土法名方四君子汤对大脑皮质的神经保护作用，探讨四君子汤脑保护作用的可能机制，以期为临床抗脑缺血/再灌注损伤提供新的思路　　1 材料　　1.1 动物　　清洁级SD 大鼠48 只， 雄性， 体质量280~300 g动物由湖南斯莱克景达实验动物有限司提供，许可证号：SCXK(湘)2013-0004常规饲养，运用12 h 交替光线进行照明，实验室通风良好，室温控制在21~26 ℃，相对湿度保持在40%~50%　　1.2 药物　　选用健脾补土名方四君子汤(由人参9 g，白术9 g，茯苓9 g，炙甘草6 g 组成)水煎液浓缩为含生药2 g/mL，4 ℃ 冰箱冷藏备用尼莫地平：购于德国拜耳公司， 规格30 mg， 溶于蒸馏水配成3.6 mg/mL 备用　　1.3 主要试剂和仪器　　TIMP1 兔抗鼠多克隆抗体(Proteintech 公司)，MMP9 兔抗鼠多克隆抗体(Proteintech 公司)，LN 兔抗鼠多克隆抗体(Proteintech 公司)，PV-9000 二步法通用试剂盒(北京中杉金桥生物公司)，DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥生物公司)。

手动石蜡切片机(中国浙江金华)，显微摄像图像分析系统(麦克奥迪实业集团公司)　　2 方法　　2.1 动物分组及给药　　将48 只SD 大鼠随机分为4 组，对照组、模型组、尼莫地平组(10.8 mg/kg)、四君子汤组(6 g/kg)每组12 只从造模前3 d 开始给药，每天1 次，剂量根据人临床剂量按动物体表面积换算，对照组、模型组大鼠用等体积蒸馏水灌胃连续灌胃14 d　　2.2 模型制备及模型筛选　　采用大脑中动脉栓塞法制备大鼠局灶性脑缺血/再灌注(focal cerebral ischemia/ reperfusion,FCIR)模型[5]运用Zea-Longa的5 级4 分评分标准对模型进行筛选：0 分，正常，无神经功能缺损;1分，左前肢不能充分伸展，轻度神经功能缺损;2 分，行走时，大鼠向瘫痪侧(左侧)转圈，中度神经功能缺损; 3 分，行走时，大鼠身体向瘫痪侧(左侧)倾倒重度神经功能缺损;4 分，不能自发行走，有意识丧失模型只保留神经功能障碍在1 级以上的大鼠，不成功者剔除，补充动物，保证每组动物12 只　　2.3 标本采集及处理　　灌胃后第15 d，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉并固定大鼠， 用200 mL 生理盐水经左心室快速灌注，至流出液变清，再用4%多聚甲醛缓慢灌注固定30 min，至肝脏变硬白后断头取脑，置于4%多聚甲醛固定4 h。

石蜡切片机做冠状切片，片厚5 μm　　2.4 指标检测　　2.4.1 神经功能评分神经功能评分参照Longa 5级4 分法，各组动物在手术完全清醒后和灌注后第15 天处死前2 h 进行评分　　2.4.2 免疫组化检测LN、TIMP1 和MMP9 表达具体步骤如下：切片脱蜡、水化组织切片;3% 双氧水孵育10 min 以阻断内源性过氧化物酶; 入PBS 修复液置微波炉修复抗原，PBS 冲洗，2 min×3 次;滴加一抗LN、TIMP1 或MMP9 (均为1∶100)，4 ℃过夜;PBS 冲洗，2 min×3 次; 滴加试剂1，37 ℃孵育20 min，PBS 冲洗，2 min×3 次;滴加试剂2(试剂盒自带)37 ℃孵育20 min，PBS 冲洗，2 min×3 次;应用DAB 溶液显色，自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片显微镜下LN 主要为细胞外基质染成棕黄色颗粒状TIMP1、MMP9 阳性主要表达于细胞质，为黄色或棕黄色采用彩色图像分析系统，每张切片400倍下随机取6 个不重叠的视野，测定阳性表达的面积密度及平均光密度， 计算整合光密度值(IOD)，IOD=面积密度×平均光密度;阳性反应越大，表示反应越强。

　　2.5 统计学分析　　应用SPSS 17.0 统计软件进行分析， 所有数据均采用x±s表示组间两两比较方差齐者用LSD法检验，方差不齐者用Dunnett's T3 法检验，P<0.05为差异有统计学意义　　3 结果　　3.1 各组大鼠肢体神经功能评分情况　　与对照组比较，模型组神经功能评分显著增加，差异有显著统计学意义(P<0.01);与模型组比较，四君子汤组、尼莫地平组神经功能评分均明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)，且四君子汤组、尼莫地平组组间差异无统计学意义(P>0.05)　　3.2 四君子汤对FCIR 大鼠大脑皮质LN 蛋白表达的影响　　对照组LN 在神经元及血管细胞外基质呈强阳性表达，染色呈深棕色，厚度适中模型组、四君子汤组、尼莫地平组表达减弱, 染色较淡和厚度变小等对照组LN 在颞叶皮质表达呈强阳性表达;模型组LN 表达明显降低，染色淡;四君子汤组和尼莫地平组LN 表达降低，染色较淡模型组大脑皮质LN阳性表达明显低于对照组(P<0.01)，四君子汤和尼莫地平组LN 阳性表达明显高于模型组(P<0.01)　　3.3 四君子汤对FCIR 大鼠大脑皮质TIMP1、MMP9蛋白表达的影响　　胞浆或胞核着色呈棕黄色为TIMP1 阳性细胞。

对照组偶见少量TIMP1、MMP9 阳性表达; 模型组TIMP1、MMP9 阳性表达应激性升高;四君子汤组和尼莫地平组TIMP1 阳性表达增多，MMP9 阳性表达减少模型组大脑皮质TIMP1、MMP9 阳性表达明显高于对照组(P<0.01)四君子汤和尼莫地平组TIMP1阳性表达明显高于模型组(P<0.01)，而MMP9 阳性表达明显低于模型组(P<0.01)作用下降解，同时，导致细胞间信号传递失调，从而造成神经元损伤、凋亡，即所谓失巢凋亡脾为后天之本，气血生化之源是中医学的基本理论之一，脾者土也土者生万物，土为坤元，至哉坤元，万物滋生，坤厚载物而ECM 是神经元赖以生存的外环境和载体，如同神经元的巢穴，具有承载、营养、保护、促进神经元突触生长、促进干细胞转化为神经元的作用， 从这一角度来看，ECM 的功能当属中医学脾土功能的范畴，而失巢凋亡当属脾虚承载功能不足的范畴神经细胞外ECM 的破坏和降解在FCIR 损伤过程中发挥重要作用，LN为ECM 的重要组成成分李瑞梅等[8]研究发现FCIR后LN 的表达先降低后回升， 与血脑屏障的病理性改变有关，其可造成继发性脑水肿损伤;与促使新生血管生成相关联。

TIMPs 是MMPs 的特异性抑制剂，特异性抑制MMPs 的活性当机体出现缺血缺氧性变化出现在脑组织中时，大量的MMP9 将由组织中的血管内皮细胞以及中性粒细胞分泌并且释放， 同时，MMP9 与炎症的发生关系较为密切，ECM 的降解与其释放呈正相关，可能增加血脑屏障的通透性，进一步诱导血管脑源性水肿正常情况下，MMPs 和TIMPs相互作用， 使ECM 处于动态平衡中因此， 如果MMP 和TIMP 之间的平衡被打破，有可能会影响到ECM 的合成与降解黄越等[10]研究发现TIMP1 在新生鼠缺血脑组织表达明显增加，可能与新生鼠缺血脑组织损伤有关　　四君子汤出自《太平惠民和剂局方卷三》，是健脾补土的名方，该方以人参为君，甘温益气，补中健脾养胃;白术苦温，健脾燥湿，湿去脾自健，合人参益气助运之力为臣;茯苓甘淡为佐，健脾渗湿，苓术合用，则进一步增强健脾除湿以及运化之力;炙甘草甘温， 益气和中，调和诸药，共同发挥补气健脾功效为使四药配伍，共奏益气健脾之功脾为后天之本，气血生化之源，《灵枢海论》记载脑为髓之海脑，《素问脉要精微论》记载头者,精明之府，其与人体的生命、精神以及感觉等方面密切相关《素问经脉别论》记载：饮入于胃，游溢精气，上输于脾，脾气散精，上归于肺。

及脾主升清，运化水谷精微濡养脑髓由此可见脾脑相关的桥梁可能通过脾胃的气机升降功能实现，为其脑部病变的防治提供了理论依据本实验结果显示，FICR 后可见明显神经功能损害，ECM 在酶解作用下降解，与文献报道基本相符， 提示ECM 在FCIR 所致神经元损伤中发挥重要作用而四君子汤组和尼莫地平组TIMP1 阳性表达高于模型组，MMP9 阳性表达明显减少，LN 阳性表达明显多于模型组， 提示四君子汤对神经功能具有保护作用， 其机制可能与促进LN 和TIMP1 表达，抑制MMP9 表达， 从而维护细胞外基质完整性、保护神经元细胞有关其具体机制有待研究现代研究表明人参皂苷Rb1可能在脑缺血死后神经可塑性中起促进作用， 与其促进大鼠局灶性脑缺血后脑白质重塑有关;研究发现人参皂苷Rg2可通过减少缺血再灌注大鼠神经功能评分，减少脑梗死面积，提高胆碱能神经活性， 对脑缺血再灌注损伤具有防护作用这可能是四君子汤脑保护作用的物质基础之一。