线虫培养(精品).doc

松材线虫病（ Bursaphelenchus xylophilus (Steiner et Buhrer) Nickle）异  名：Aphelenchoides xylophilus Steiner & BuhrerBursaphelenchus lignicolus Mamiya & Kiy分类地位：线形动物门Nemathelminthes，线虫纲Nematoda，垫刃目Tylenchida，滑刃科Aphelenchoididae寄  主：赤松、黑松、马尾松、黄松、海岸松、火炬松、湿地松、琉球松、白皮松等松属植物国外：松属、冷杉属、云杉属、雪松属、落叶松属等植物简   介:经济重要性　　松材线虫病又称松树萎蔫病，是松树的一种毁灭性流行病在我国松墨天牛是它的重要传播昆虫　　该病危害的毁灭性在于：致病力强，寄主死亡速度快；传播快，且常常猝不及防；一旦发生，治理难度大据不完全统计，我国自1982年发生该病后的10年间，发生面积约达38000hm2，造成松树死亡1400000株以上，损失木材50000m3用于病害的防治经费亦达645万元 它不仅给国民经济造成巨大损失，也破坏了自然景观及生态环境，更对我国松林资源构成严重威胁。

　　我国口岸曾从日本等国进口的木材及木制品中截获到该线虫传播途径　　该线虫主要靠木材及其制品中的媒介昆虫松墨天牛等携带作远距离传播分布　　国内：江苏、安徽、广东、山东、浙江、湖北、上海、台湾、香港；　　国外：日本、韩国、美国、加拿大危害及症状　　松材线虫通过松墨天牛补充营养的伤口进入木质部，寄生在树脂道中在大量繁殖的同时移动，逐渐遍及全株，并导致树脂道薄璧细胞和上皮细胞的破坏和死亡，造成植株失水，蒸腾作用降低，树脂分泌急剧减少和停止所表现出来的外部症状是针叶陆续变为黄褐色乃至红褐色，萎蔫，最后整株枯死病死木的木质部往往由于有蓝变菌的存在而呈现蓝灰色病害发展过程分4个阶段：　　（1）外观正常，树脂分泌减少，蒸腾作用下降，在嫩枝上往往可见天牛啃食树皮的痕迹；（2）针叶开始变色，树脂分泌停止，除见天牛补充营养痕迹外，还可发现产卵刻槽及其它甲虫侵害的痕迹；（3）大部分针叶变为黄褐色，萎蔫，可见到天牛及其它甲虫的蛀屑；（4）针叶全部变为黄褐色至红褐色，病树整株干枯死亡此时树体一般有许多次期害虫栖居发病规律　　该线虫由卵发育为成虫，其间要经过4龄幼虫期雌、雄虫交尾后产卵，雌虫可保持30天左右的产卵期，1条雌虫产卵约100粒。

在生长最适温度（25℃）条件下约4天l代，发育的临界温度为9.5℃，高于33℃则不能繁殖由卵孵化的幼虫在卵内即蜕皮1次，孵出的幼虫为2龄幼虫　　秋末冬初，病死树内的松材线虫已逐渐停止增殖，并有自然死亡，同时开始出现另一种类型的3龄幼虫，称为分散型3龄虫，进人休眠阶段，翌年春季，当媒介昆虫松墨天牛将羽化时，分散型3龄虫蜕皮后形成分散型4龄虫，特称为dauerlarvae（DL），即休眠幼虫（耐久型幼虫）这个阶段的幼虫即分散型3龄、分散型4龄幼虫在形态上及生物学特性上都与繁殖阶段不同，如角质膜加厚、内含物增多，形成休眠幼虫口针、食道退化，这阶段幼虫抵抗不良环境能力加强，休眠幼虫适宜昆虫携带传播　　松墨天牛在华东地区一般为1年1代；广东1年2-3代，以2代为主，在1年1代的地区，春天可见松材线虫分散型3龄虫明显地分布在松墨天牛蛀道周围，并渐渐向蛹室集中这主要是由于蛹室内含有大量的不饱和脂肪酸，如油酸、亚油酸、棕油酸等对线虫产生趋化活性当松墨天牛即将羽化时，分散型3龄虫蜕皮形成休眠幼虫，通过松墨天牛的气门进入气管，随天牛羽化离开寄主植物，松材线虫对二氧化碳有强烈的趋化性，天牛蛹羽化时产生的二氧化碳是休眠幼虫被吸引至气管中的重要原因。

在松墨天牛体上的松材线虫均为休眠幼虫，多分布于气管中，以后胸气管中线虫量最大，此外也会附着在体表及前翅内侧，1只天牛可携带成千上万条线虫，据记载最高可达280000条，当松墨天牛补充营养时，大量的休眠幼虫则从其啃食树皮所造成的伤口侵入健康树松墨天牛在产卵期线虫携带量显著减少，少量线虫也可从产卵时所造成的伤口侵入寄主，休眠幼虫进入树体后即蜕皮为成虫进入繁殖阶段，大约以4天l代的速度大量繁殖，并逐渐扩散到树干、树枝及树根被松材线虫侵染了的松树大抵是松墨天牛产卵的对象翌年松墨天牛羽化时又会携带大量线虫，并接种到健康树上，如此循环，导致松材线虫的传播检验及鉴定1、检验方法　　对应施检疫物首先直接观察是否存在木质干枯、木质部蓝变和媒介昆虫或它的栖居痕迹等症状，然后进行室内检验　　（1）抽样和取样抽取有上述症状的部分检疫物，数量为每批次总件数的0.5％-5.O％，但最低不得少于5件若无明显症状时可随机抽样在所抽取的样木（或样品）上取部分样品，或钻取少量木屑（不得少于20g），每样3个重复，标号后带回实验室检验必要时可将整件样木（或样品）带回备检取样时注意选取靠近蛀道、蛹室的部位，所取样品不得带有树皮。

　　（2）分离线虫将各标号样品分别进行线虫分离分离线虫可采用贝尔曼（Baermann）漏斗法或浅盘法对媒介昆虫进行线虫分离时，可将其用剪刀或尖头镊子、解剖针等剪碎或撕碎后同样采用上述方法进行分离时若室温较低（不得低于7℃）可根据室温高低将分离用水调至20-40℃（不得超过40℃）后浸泡分离材料，3-4小时线虫游离出一定数量后即可镜检一般需经24小时后镜检2、病原鉴定　　（1）线虫培养：鉴定需要相当数量的雌、雄成虫，但在检验时分离到的线虫多是处于休眠阶段的分散型3龄虫（L）；有时虽可见雌雄成虫，但数量较少；而从媒介昆虫分离到的线虫则只能是被称为休眠幼虫（DL）的分散型4龄虫，因此，需将上述情况的线虫进行培养，以获得大量雌雄成虫供鉴定　　（2）临时玻片制作　　杀死和固定：将盛有线虫悬浮液的小烧杯置于65℃水浴中2min杀死线虫，经离心浓缩后即用三羟基乙胺福尔马林固定液（TAF）固定制片：在洁净的载玻片上滴1小滴水，水滴大小以加盖玻片后恰好充满盖玻片下的空间为宜在解剖镜下挑选经固定后的雌雄成虫各2条，摆在水滴中并使其沉没，从水滴的一侧缓缓加上盖玻片，避免出现气泡，用熔化的蜡烛或指甲油封片　　（3）虫体测计。

根据德曼氏（De Man）公式分别测量虫体上各个特征器官的长短和位置，用不同的符号来表示，一般雌雄虫各测20-60条，取平均值L＝体长（μm）a＝体长／最大体宽b＝体长／头端至食道和肠连接处之长c＝体长／尾长（自肛门至尾尖）V（％）＝（头端至肛门之长／体长）X l00％St＝口针长度（um）Sp＝交合刺长度(um)　　（4）形态鉴定成虫虫体细长，约1mm头部唇区高，缢缩显著，口针细长，基部略微增厚，使口针基结清晰中食道球卵圆形，占体宽的2／3以上，食道腺细长叶状，覆盖于肠背面排泻孔的开口大致和食道与肠交接处平行半月体在排泻孔后约2／3体宽处雌虫热杀死后体态呈开阔"C'形尾部亚圆锥形，末端钝圆，少数有微小的尾尖突（不超过2um）卵巢1个，前伸，卵呈单行排列，阴门开口于虫体中后部约73％处，开口处有后伸的宽的阴门前唇（阴门盖）覆盖后子宫囊长，约为阴肛距的2/3　　雄虫热杀死后体呈"J"形，尾端尖细，侧观呈爪状，腹部弯曲，为卵形交合伞所包裹（腹面观）交合刺大，弓状，成对，喙突显著，交合刺远端膨大如盘状　　松材线虫的近似种是与拟松材线虫（B. mucronatus），在形态上的主要区别是：　　拟松材线虫雌虫尾部呈圆锥形，尾端指状，有明显的尾尖突，长约3.8-5.7μm，其幼虫尾部与成虫相似，尾尖突略短，对同样有尾尖突的松材线虫个体则以雌虫尾尖突长短来区分：尾尖突长约1μm（不超过2μm）的为松材线虫；尾尖突长达2.0μm以上的则为拟松材线虫。

同样，也可利用幼虫尾部类似情况，作为鉴定的辅助手段　　（5）线虫的保存经鉴定的松材线虫在许多情况下需保存备查一般采用甘油缓慢脱水法，使线虫体内的水分充分为甘油所替代，之后，或在纯甘油中保存，或制成永久玻片标本保存防治方法　　1、检验中发现有携带该线虫的松木及包装箱等应采取溴甲烷熏蒸处理（具体方法略），或浸泡于水中5个月以上，或切片后用作纤维板、刨花板或纸浆等工业原料及作烧炭等燃料用　　2、对利用价值不大的小径木、枝桠等可集中烧毁，严禁遗漏。