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毕 业 论 文〔设计题 目用HPLC法同时测定配制酒中四种芳香物质方法研究 指导老师 张 波 专业班级食品营养与检测112 姓 名 王秀云 学 号 20117100238 20XX5月28日7 / 10.摘要：本文建立了同时检测配制酒中β-苯乙醇、苯乙酮、丁香醇、肉桂醇共4种芳香物质的高效液相色谱〔HPLC分析方法样品经稀释后用固相萃取柱净化后,用5ml水清洗,5ml甲醇洗脱采用Zobax SB-C18色谱柱<4.6 mm×150 mm,5 μm>,以甲醇和水作为流动相,梯度洗脱各目标组分回收率在91.4 %～105.6 %之间,相对标准偏差为0.3 %～2.1 %该方法快速、简便、灵敏、结果准确可用于配制酒中4种芳香物质的同时检测关键词：芳香物质；快速；简便；检测.目录引言 11 材料与仪器 21.1 实验材料 21.2实验仪器 21.3实验试剂22.实验方法22.1 色谱条件 22.2 样品前处理 33 结果与分析 33.1 色谱条件的优化 33.2固相萃取条件的优化 43.2.1 不同固相萃取柱效果的比较 53.2.2 洗脱液的选择 53.3线性范围及检出限 53.4回收率和精密度 63.5 实际样品测定 9结论 9参考文献 10.引言酒是人类生活中的主要饮料之一。

中国酿酒历史源远流长,品种繁多,名酒荟萃,享誉中外黄酒是世界上最古老的酒类之一,约在三千多年前,商周时代,中国人独创酒曲复式发酵法,开始大量酿制黄酒约一千年前的宋代,中国人发明了蒸馏法,从此,白酒成为中国人饮用的主要酒类[1]配制酒又称调制酒它的诞生晚于其他单一酒品,但是发展很快,配制酒主要有两种配制工艺,一种是在酒和酒之间进行勾兑配制,另一种是以酒和非酒精物质进行勾调配制[2]酒中的芳香物质是反映酒类品质好坏的重要因素之一酒中的芳香物质大约有三百多种分别归属于醇类、酯类、有机酸、羰基化合物、酚类、萜烯类化合物等[3]酒的风味跟芳香物质有很大的联系,酒中芳香物质越多,酒的风味就越浓厚酒中的芳香物质, 对酒的优劣、质量评价系统的建立及酿酒工艺实施具有重要的理论与实践意义目前国标方法中酒类中芳香物质的分析大多采用气相色谱法,如 GB/T 10345《白酒分析方法》和GB/T 13662《黄酒》中都采用气相内标法测定,此方法要用到白酒分析专用柱,成本较高,周期长,干扰大,重现性差,回收率低并且需要准确地加入内标物,其他分析酒的毛细管柱中难以找到成分相似、相近出峰的内标物而采用气相外标法往往采用热柱头分流进样法,容易引起样品的热分解和歧视现象,导致检测结果误差波动较大[4,5]。

相比较气相色谱法,高效液相色谱法分析速度快且重现性好,不受试样的挥发性和热稳定性限制,应用范围广；流动相种类多,可通过流动相的优化达到高的分离效率；一般在室温下分析即可,不需高柱温目前有关使用HPLC 测定酒类产品中芳香物质的研究较少[6]但是此类方法只对单一的芳香物质含量做了分析讨论或者只针对一类产品,而用高效液相色谱同时测定酒类中多种芳香物质的方法尚未有报道[7]如何来分析酒中的芳香物质就显得尤为重要本研究以β-苯乙醇、苯乙酮、丁香醛、肉桂醛四种芳香物质为研究对象,探索一种快速、简便、灵敏、准确的酒类中芳香物质含量的检测方法1材料与仪器1.1实验材料从市场上随机选择3种配制酒.1.2实验仪器Agilent 1260 Infinity 高效液相色谱仪配二极管阵列检测器〔Agilent公司；固相萃取柱：Oasis HLB cartridge <3 cc,60 mg Waters公司 >液相色谱柱：Agilent SB-C18柱<4.6 mm×150 mm,5 μm,Agilent 公司>；氮吹仪:HGC-36A,<天津市恒奥科技发展有限公司分析天平：AL204-IC1.3实验试剂标准物质：β-苯乙醇<≥99%>、苯乙酮<≥99%>、丁香醛<≥99%>、肉桂醛<≥99%>〔Sigma-Aldrich公司,甲醇为色谱纯〔Merck公司；实验用水为Milli-Q超纯水；标准溶液的配制：分别准确称取β-苯乙醇、苯乙酮、丁香醛、肉桂醛100 mg于100 mL 容量瓶中,用甲醇溶解,配制成1.0 mg/mL的储备液,密封储存于4 ℃冰箱中；再准确吸取1.0 mg/mL 的标准储备液1 mL于10 mL容量瓶中,用甲醇定容得100 µg/mL的中间标准溶液。

用流动相将中间标准溶液稀释成一系列浓度的标准溶液,待测2.实验方法2.1色谱条件液相色谱柱：Agilent SB-C18柱<4.6 mm×150 mm,5 μm,Agilent 公司>；柱温:40 ℃；进样量20 μL；流动相：甲醇水梯度洗脱,流动相如表2.1所示,流速1.0 mL/min检测波长：β-苯乙醇：210 nm、苯乙酮：245 nm、丁香醛、肉桂醛：298 nm表2.1 流动相梯度时间〔min水〔%甲醇,〔%0.080.020.04.080.020.017.040.060.021.020.080.021.280.020.02.2样品前处理准确移取10 mL配制酒样品加纯水稀释,使其酒精度小于12 %volHLB固相萃取柱用3 mL甲醇,3 mL水活化,完全转移稀释后的样品过固相萃取柱,保持1滴/秒的流速样品通过固相萃取柱净化后,用5 mL水清洗后慢慢排干水分,5 mL甲醇洗脱,40 ℃氮气吹至近1mL,用水定容至2 mL,0.22 μm滤膜过滤,待测3结果与分析3.1色谱条件的优化流动相梯度选择：在不影响分离效果的前提下, 为提高分离效率, 采用梯度洗脱考察了甲醇比例在20%～80%时的洗脱状况, 确定了洗脱梯度<见表2.1>。

检测波长：将4种芳香物质在190 nm～350 nm作紫外光谱扫描, 得到各物质的最大吸收波长：β-苯乙醇为210 nm、苯乙酮244 nm、丁香醛310 nm、肉桂醛291 nm试验检测波长为210 nm、245 nm和298 nm时各物质的响应情况,各物质的响应均很高,故将检测波长定为210 nm、245 nm和298 nm4种物质的光谱图如图3.1所示不同色谱柱分离效果的比较：本实验选择了3 根C18 色谱柱,在不同的色谱分离条件下对相同的样品进行分析,比较分析结果,最终发现用Agilent SB-C18<4.6 mm×150mm,5 μm>的分离效果最好图3.1 四种芳香物质的光谱图: 1.β-苯乙醇 2.苯乙酮 3.丁香醛 4.肉桂醛3.2固相萃取条件的优化配制酒的酒精度通常为12% vol～52% vol,由于酒精度可能会影响目标物在柱子上的萃取效率,因此实验首先考察不同的酒精度对固相萃取效率的影响实验采用Oasis HLB cartridge <3mL,60 mg>柱,对不同酒精度〔12% vol, 15% vol, 22% vol, 28% vol, 32% vol, 38% vol, 42% vol, 48% vol, 52% vol10 mL的溶液<加标浓度2 mg/L>进行固相萃取实验,对流出液进行分段收集,检测最后1mL流出液是否含有目标物。

结果表明,酒精度小于等于15 %vol的测试液,流出液未检出目标物,说明此时目标物在固相萃取柱上的保留为100 %选择12% vol和15% vol,两种不同酒精度标准液模拟测试各目标物在HLB萃取柱上的最大保留体积用加标溶液<2mg/L>进行测试,接取分段流出液上机检测12% vol和15% vol的标准液过柱后检测到目标物时的体积分别为80 mL和70 mL结果表明,随着酒精度的增加,检测目标物越早,说明酒精度越高对目标物的洗脱作用越强,综合考虑采用12%的乙醇溶液进行后续实验,对实际样品中酒精度大于12 %的样品采用加入一定比例的纯水稀释的方法达到12 %3.2.1 不同固相萃取柱效果的比较本实验考查了五款固相萃取柱：Waters Oasis HLB cartridge<3mL/60 mg>、WatersOasis MCX cartridge <3mL/60 mg >、Waters C18<3mL/60 mg>、Agela Cleanert PWAX <3mL/60 mg >、Agela Cleanert PCX <3mL/60 mg >对各目标物的保留情况将10 mL溶液加标2 mg/L 的12 %乙醇水过柱,5 mL甲醇洗脱,收集洗脱液,氮气吹至近1mL,用水定容至2mL,上机测得回收率如表3.1。

表3.1不同固相萃取柱回收率固相萃取柱β-苯乙醇, %苯乙酮,%丁香醛,%肉桂醛,%Waters Oasis HLB93.198.899.2101.4Waters Oasis MCX60.373.678.892.8Waters C1811.319.413.033.8Agela Cleanert PWAX31.372.969.768.5Agela Cleanert PCX52.672.374.590.9通过上表的数据可以看出,Waters Oasis HLB柱的回收率最高,故本实验选择该柱对样品进行净化浓缩3.2.2洗脱液的选择将10 mL溶液加标2 mg/L的12 %乙醇水,过Oasis HLB cartridge <3mL/60 mg>柱,分别用5 mL甲醇洗脱,收集洗脱液,氮气吹至近干,用水定容至2 mL,上机结果表明,5 mL甲醇能完全洗脱吸附在HLB柱上的目标物,故选其作为洗脱剂3.3线性范围及检出限对四种物质的标准液进行检测,以仪器响应的峰面积Y对应浓度X进行线性回归,得到各物质的标准曲线方程、线性范围和相关系数各物质在相应浓度范围内的线性良好,结果列于表3.2采用空白样品处理液加标,以S/N=3计算方法的检出限,以S/N=10计算方法的定量限,再折算样品的检测限和定量限。

图3.2 四种芳香物质的标准曲线图: 1.β-苯乙醇 2.苯乙酮 3.丁香醛 4.肉桂醛表3.2 线性回归方程物质曲线方程相关系数R检出限定量限β-苯乙醇y = 57.74x - 1.11960.99980.020.06苯乙酮y = 115.68x - 4.80680.99990.020.06丁香醛y = 151.04x - 12.99720.99980.020.06肉桂醛y = 221.15x - 14.87300.99980.010.033.4回收率和精密度用优化后的处理方法对已知不含上述四种目标物的配制酒进行3种浓度的混标的加标回收实验, 3次平行测定< n = 3>的平均回收率和RSD 结果如表3.3所示由表中数据可知, 各物质的回收率范围在87.0 %～105.6 %, RSD范围在0.3 % ～2.1 % , 说明本方法满足定量分析的要求标样谱图、加标谱图、空白谱图如图3.3所示表3.3 配制酒中加标回收实验物质本底值加入量加标后测定值回收率<%>RSD<%>β-苯乙醇00.200.19798.5。