叶绿素方法选择.doc

方法选择 1、分光光度计法>荧光光度法>SPAD速测法浸提比色法>萃取比色法常温浸提比色测定>高温速浸提比色法如果时间条件允许建议选择常温浸提比色法 2、药品的选择常用有机浸提叶绿素的试剂由甲醇、乙醇、丙酮乙醇对身体的伤害最小丙酮最厉害如果通风条件不是太好建议选择乙醇有机试剂混合液提取具有协同优势乙醇与丙酮的混合液比甲醇与丙酮的混合液甲醇乙醇混合很少浸提的要完全而且稳定乙醇、丙酮、水的浸提效果次之差异不显著综上如果能买到丙酮的话乙醇、丙酮以1:3的比例混合液提取最好其次是乙醇、丙酮、水以4.5:4.5:1的比例混合液如果不想用丙酮可以用95%的乙醇代替但是与混合液比提取效率不高 3、称样量0.2g样品选用20ml浸提液浸提0.5g样品选用50ml浸提液浸提 二、 实验原理 分光光度法测定叶绿素(包括a\b\类胡萝卜素\总量) 含量的原理是以有机溶剂在常温暗室直接提取样品中的叶绿素测定其吸光度根据叶绿素(包括a\b\类胡萝卜素\总量)在特定波长的吸收用公式计算其含量 三、 器材 棕色容量瓶、721型分光光度计751型分光光度计更好越精确越好 四、 步骤 1、 将叶片洗净选取中间部分称0.200克左右并剪成2mm左右碎条 2、 将样品放入容量瓶中加入浸提液定容放在暗处26h左右 3、 比色如果仅仅测定叶绿素A\B总量测定波长在665nm、649nm、652nm处吸光度即可如果还测定类胡萝卜素含量再测定处波长在470nm处的吸光度即可。

目前不同的浸提液提取方法都是在这些波长下测定的 4、 每个实验样品重复三次空白两次重复即可本实验中空白意义不大 五、 计算 Ca=13.95*A665-6.88*A649 Cb= 24.96* A649-7.32* A665 C类胡萝卜素= (1000*A470-2.05* Ca -114.8* Cb)/245 C总= A652*50/(34.5*m) Ca 为叶绿素a的浓度 M 为称样量 一、 叶绿素的测定：乙醇提取比色法，参考陈建勋、王晓峰等方法，有改动 将实验材料去除大主脉，在0.0001的天平上称取0.5g左右的叶片至于50ml离心管中，依次加入25ml95%的乙醇密封，在黑暗条件下室温提取24-36h，将提取液稀释一定的倍数（根据具体情况而定），随后在UV754N紫外可见分光光度计，波长665、649、470nm下分别进行比色根据各波长的 OD 值按照李合生的方法计算叶绿素 a、b 和类胡萝卜素的浓度（mg·L-1），根据求得的浓度计算出各色素含量（mg·g-1鲜重表示）Ca=13.95D665－6.88D649Cb=24.96D649－7.32D665 Cx.c=(1000D470－2.05Ca－114.8Cb)/245  色素在叶片中的含量(mg /g)=色素浓度(mg /L)×提取液总体积(m l)×稀释倍数/样品质量(g)。

摘要: 叶绿体色素溶液各组成成分在可见光谱中具有不同的特征吸收峰因此，应用分光光度计在某一特定波长下所测定的吸光度叶绿体色素的提取常用丙酮和乙醇有机溶剂叶绿体色素95 ％乙醇提取液中叶绿素 a 和 b 及类胡萝卜素分别在 665nm ,649nm 和 470nm 波长下具有最大吸收峰，据此所测得的吸光度值代人不同的经验公式（见结果计算），计算出叶绿体色素乙醇提取液中叶绿素 a 和 b 的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的总浓度，并依据所使用的单位植物组织（鲜重、干重或面积），求算出色素的含量 一、 实验原理与实验目的 实验原理： 利用95%乙醇提取叶绿体色素，叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素最大吸收峰的波长分别是665nm、649nm和470nm     根据分光光度计测定的吸光度值，可以计算出乙醇提取液中叶绿体色素含量 实验目的： 掌握分光光度法对叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总浓度和类胡萝卜素总浓度测定和计算的方法二、 实验材料和方法 植物材料：菠菜叶片 、番茄幼苗叶片 实验用具：分光光度计、天平、研钵、漏斗、剪刀、容量瓶、烧杯、滤纸、滴管等  实验试剂：95%乙醇、石英砂和碳酸钙 试验方法：分光光度法 三、 实验步骤 1、 叶绿体色素的提取 取新鲜菠菜叶片（或番茄幼苗叶片）0.5克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;加入少许石英砂和CaCO3,再加入95%乙醇3ml,研磨成匀浆,再加95%乙醇10ml,静置10分钟;用漏斗滤去残渣,用丙酮反复冲洗研钵、残渣至无色;用容量瓶定容至50ml 。

2、吸光度的测定 取光径1cm比色杯，注入上述叶绿素提取液,以95%乙醇注入另一同样的比色杯内作为空白对照,在波长665、649和470nm下测定吸光度 3、结果计算依据下列丙酮提取液中色素浓度计算公式,分别计算出叶绿素a、b的浓度及其叶绿素总浓度和类胡萝卜素的浓度 附录：722分光光度计的使用 1、 选择灵敏度旋纽至3；将波长调节到600nm，打开样品室盖，打开电源开关预热20min2、打开样品室盖，将测定旋纽调至T（透光度），用调节旋纽0调0；盖上样品室盖，用调节旋纽100调100  3、将空白样品放入样品槽，按上述方法调0和调100  4、将测定旋纽调至A（吸光度），用Abs旋纽调0，测定待测样品的光密度 计算公式 ： 5 95%乙醇提取液中色素浓度的计算  Ca（叶绿素a）=13.95A665 – 6.8A649  Cb（叶绿素b）=24.96A649 – 7.32A665  CT（叶绿素）=Ca+Cb=18.16A649 + 6.63A665  Cx.c（类胡萝卜素）=(1000A470 – 2.05Ca-114.8Cb)/248叶绿体色素含量=   四、 实验结果与讨论 1、菠菜叶片不同波长下的吸光度(0.42g) 波长（nm） 吸光度 平均值 665 0.702 0.683 0.755 0.7133 649 0.328 0.326 0.340 0.3313 470 0.823 0.827 0.861 0.8370  Ca（叶绿素a）=13.95*0.7133 – 6.8*0.3313= 7.6977mg/L Cb（叶绿素b）=24.96*0.3313– 7.32*0.7133=3.0479mg/L CT（叶绿素）=Ca+Cb=18.16*0.3313 + 6.63*0.7133= 10.7456mg/L Cx.c（类胡萝卜素）=(1000A470– 2.05Ca-114.8Cb)/248=1.8995mg/L  ）或积，样品鲜重（或干重、面稀释倍数）提取液体积（）色素浓度（21.mgLLCa（叶绿素a）含量=7.6977mg/L*0.05L*1/0.42g=91.64mg/g Cb（叶绿素b）含量= 3.0479mg/L*0.05L*1/0.42g=36.28mg/g Cx.c（类胡萝卜素）含量=1.8995mg/L*0.05L*1/0.42g=22.61mg/g 叶绿素含量测定方法---丙酮法  由于微藻的生长周期比较复杂，包括无性繁殖阶段和有性繁殖阶段，其在不同阶段的生理形态不同，有时藻细胞会聚集在一起，以片状或团状形式存在，在显微镜下难以确定其所包含的细胞数量。

 藻细胞中叶绿素的含量（特别是叶绿素a的含量）通常随与细胞的生长呈较好的线性关系，因此可通过测定藻细胞中叶绿素含量变化来反映微藻的生长情况 叶绿素测定采用丙酮研磨提取法 取适量藻液于10 mL离心管中在4000 rpm转速下离心10 min，弃去上清液，藻泥中加入适量的100 %的丙酮采用丙酮提取法时在试管研磨器中冰浴研磨5 min，4000 rpm离心后，上清液转入10 mL容量瓶中按上述方法对藻体沉淀进行萃取，直至藻体沉淀呈白色为止定容后，采用722S型可见分光光度计分别测定645 nm和663 nm下萃取液的吸光值，叶绿素含量用以下公式进行计算（Amon,1949）： 叶绿素a含量用以下公式进行计算：Chlorophyll a (mg/L) = (12.7×A663 nm－2.69×A645 nm)×稀释倍数  叶绿素b含量用以下公式进行计算： Chlorophyll b (mg/L) = (22.9×A645 nm－4.64×A663 nm)×稀释倍数  叶绿素总含量用以下公式进行计算： Chlorophyll a＋b (mg/L) = (20.2×A645 nm＋8.02×A663 nm)×稀释倍数 由于丙酮的沸点较低，较高温度下挥发很快。

此外，叶绿素稳定性较差，见光易分解，因此，本实验中叶绿素的提取和测定均在低温黑暗条件下进行，以减少提取过程中的损失Chlorophyll a (mg/L) = (12.7×A663 nm－2.69×A645 nm)×稀释倍数  叶绿素b含量用以下公式进行计算： Chlorophyll b (mg/L) = (22.9×A645 nm－4.64×A663 nm)×稀释倍数  叶绿素总含量用以下公式进行计算： Chlorophyll a＋b (mg/L) = (20.2×A645 nm＋8.02×A663 nm)×稀释倍数 由于丙酮的沸点较低，较高温度下挥发很快此外，叶绿素稳定性较差，见光易分解，因此，本实验中叶绿素的提取和测定均在低温黑暗条件下进行，以减少提取过程中的损失一、 实验原理和目的    根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比  叶绿素(丙酮)在652nm(混合）、663nm、645nm有最大吸收峰 叶绿素(95%乙醇)在665nm、649nm，类胡萝卜素在470nm有最大吸收峰，根据在分光光度计下测定的吸光度，求得叶绿素的含量 二、 实验器具和步骤  植物材料： 女贞 实验器具： 分光光度计；电子天平； 研钵； 试管；  小漏斗；滤纸； 吸水纸； 移液管 ；量筒； 剪刀 试剂： 95％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉 步骤：1.称取剪碎的新鲜样品0.1g 左右，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3～5ml 95％乙醇，研成均浆，继续研磨至组织变白。

静置3～5min 2. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到10ml试管中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中  3.用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入漏斗中直至滤纸和残渣中无绿色为止最后用乙醇定容至10 ml ，摇匀 4. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度 5. 计算公式：  叶绿素的含量（mg/g）= (浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重 一、 实验原理和目的    根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比  叶绿素(丙酮)在652nm(混合）、663nm、645nm有最大吸收峰 叶绿素(95%乙醇)在665nm、649nm，类胡萝卜素在470nm有最大吸收峰，根据在分光光度计下测定的吸光度，求得叶绿素的含量 二、 实验器具和步骤  植物材料： 女贞 实验器具： 分光光度计；电子天平； 研钵； 试管；  小漏斗；滤纸； 吸水纸； 移液管 ；量筒； 剪刀 试剂： 95％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉 步骤：1.称取剪碎的新鲜样品0.1g 左右，放入研钵中，加少量石英砂。