细胞工程动物组织和细胞培养(精).docx

培养细胞的生物学特征（一）体外培养细胞的分型1贴附型:大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞.有机体的绝大多数细胞必须粘附于一固相表面才能生存和生 长按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型1）成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵 圆形核，胞质突起，生长时呈放射状例心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮成纤维细胞2）上皮细胞:细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形 核，细胞彼此紧密相连成单层膜如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、 肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态上皮型细胞3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，呈活跃游走或变形运动, 方向不规则此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区 别如单核细胞、嗜酸性粒细胞4、多型细胞型:・有一些细胞，如神经细胞难以确定其规 律和稳定的形态，可统归于此类2悬浮型：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞 及白血病细胞胞体圆形,不贴于支持物上， 呈悬浮生长这类细胞容易大量繁殖二）培养细胞的生长和增殖过程1 培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells)所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长 的时间据纂1 仃限細胞系 1_少阪细咆二20 H图5-4 培养细胞的生命期1・ 原代培养 (Primary Culture) 期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养 到第一次传代阶段，一般持续1一4周。

此期细胞 呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛 •初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能 活动上相似性大细胞相互依存性强2. 传代期：•初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系(Cell Line)•在全生命期中此期的持续时间最长•在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能 维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体 细胞系(Diploid Cell Line)•为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期 或传代后早期冻存•当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存•一般情况下当传代10〜50次左右，细胞增殖逐 渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期3・衰退期：•此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形 态轮廓增强，最后衰退凋亡•在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何 一点(多发生在传代末或衰退期)，由于某种因素的 影响，细胞可能发生自发转化(Spontaneous Transformation)•转化的标志之一是细胞可能获得永生性(Immortality )•细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能 力，这样的细胞群体称无限细胞系(Infinite Cell Line),也称连续细胞系(Continuous Cell Line)。

•无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三 期初阶段细胞获不死性后，核型大多变成异倍体(Heteroploid)•细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也 可能永生性.1020_ Primary( [018 - Culture i培养细胞生命期Finite Cell LineContinuous Cell Line >」QquJnN --00 ①>le-nEno1014 一1012 -1010 -108 -传代期2nd SubcultureSenescence and Cell DeathExplanationo： Subculture IntervalI106Serial Passage0 2 4 6 8 10 12Weeks in Culture2组织培养细胞一代生存期所谓细胞“一代，一词，系仅指从细胞 接种到分离再培养时的一段时间，如某一 细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传 代153次它与细胞倍增(Doubling)不同; 在细胞一代中，细胞能倍增3〜6次细胞 传一代后，一般要经过以下三个阶段：1・潜伏期(Latent Phase):•细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状 态的悬浮期。

•此时细胞胞质回缩，接着是细胞附着或贴附于底物 表面上，称贴壁，悬浮期结束•各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基 成分和底物的理化性质等密切相关•初代培养细胞贴附慢，可长达10〜24小时或更多； 连续细胞系和恶性细胞系快，10〜30分钟即可贴附•支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附•另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接 素(Fibronectin),细胞表面蛋白(Cell Surface Proteim CSP)等也参与贴附过程•细胞接种密度大时潜伏期短b)旧)扩展细胞贴附2.指数增生期(Logarithmic growth Phase):•这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多•一般以细胞分裂指数(Mitotic Index： MI)表示， 即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数•一般细胞的分裂指数介于0.1%〜0.5%,初代细胞 分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达 3% 〜5%A接触抑制：在罷轟器矗豐晶舟當•指数增生期持续 3〜5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片细胞相互接触后，如培养的是 正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种 现象称援触抑制(Contact Inhibition)。

B密度抑制：细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要 营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍 在增多但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减 少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响， 贝II发生密度抑制(Density Inhibition),导致细胞分裂停止3・停滞期(Stagnate Phase):细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期此时细胞数量不再增加，故也称平台期（Plateau）停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离田一部分细胞 和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程 叫传代（Passage或） □〔、体外培养细胞的种类(一)初代培养初代培养又称原代培养，即直接从体內取出的细胞、组 织和器官进行的第一次的培养物一旦已进行传代培养(Subculture)的细胞，便不再称 为初代培养，而改称为细胞系一)细胞系初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞 系如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系(Finite Cell Line)；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连 续细胞系或无限细胞系(Infinite Cell Line)。

无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可 能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系三）细胞株从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培 养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群， 称细胞株四）肿瘤细胞系或株这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主 要为这类细胞肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮 型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异 体接种致瘤性HeLa：CHO： 宫-743：细胞系或细胞株的命名为供体患者的姓名(来源于宫颈癌)中国地鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary)宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立细胞系或株的鉴定、管理和使用ATCC入库细胞要求检测项目如下：培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、 供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等冻 存液：培养基和防冻液名称细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性培 养 液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血 清来源和含量。