蛋白质的测定作业指导书.doc

蛋白质的测定作业指导书1.1 开氏法测定粗蛋白质适用范围 本法适于谷物及油料作物种子中粗蛋白质测定，是农牧渔业部部颁标准法，即用开氏法测总氮量，再乘以蛋白质换算因数，而得粗蛋白质含量试剂配制(1) 1/2 0.2mol/L硫酸标准液(此浓度适用于谷类作物种子)或1/2 0.05mol/L硫酸标准液(此浓度适用于大豆种子)(2)浓硫酸(3)混合催化剂：称取硫酸钾(或硫酸钠)100g，硫酸铜10g，均匀混合后研细(通过0177mm孔径)，贮于瓶中4)蔗糖(分析纯)测定步骤 将选有代表性种子，按四分法取样后，置60℃烘箱中干燥，用粉碎机磨碎，通过0.05mm孔径，置磨口广口瓶中保存称样0.5000—0.1000g，放入100ml开氏瓶中，放入2—4g混合催化剂和5—8ml浓硫酸，混匀放置过夜将开氏瓶倾斜置于电炉上，开始用小火加热，待泡沫停止后加大火力，保持开氏瓶中液体连续沸腾，沸腾的酸应在开氏瓶颈中部冷凝回流，待消煮液无微小碳粒并呈透明的浅绿色时，继续消煮30min(含蛋白质高的样品，如豆类，需煮60min)待消煮液稍冷却后，无损地移入100ml容量瓶中，多次用水洗涤，冷却后定容。

放置澄清用移液管吸取待测液5.00或10.00ml(含NH4+—N约1mg)，放入半微量定氮蒸馏装置中，加入约5ml40%的氢氧化钠进行蒸馏按同样条件，称0.1g蔗糖代替样品做空白试验结果计算粗蛋白质%=[SX()(V-V0)0.014分取倍数〖〗W(1-水分率)〖SX〗]K100 式中：V—滴定样品时所用标准酸的毫升数；V0—空白测定所用酸的毫升数；M—标准酸的摩尔浓度；0．014—氮的毫摩尔质量g/mmol；取用量倍数—本操作步骤中为100/5或100/10，即为20或10；W—称样重(g)；K—蛋白质的换算因数一般情况下为6.25，这是由蛋白质平均含氮量为16%计算而得，即100/16=6.25但由于各种作物蛋白质中含氮量不同，其换算因数也各不相同各类作物蛋白质换算因数，可见表各类作物的蛋白质换算因数作物（种子）蛋白质换算因数麦类、杂豆类水稻高粱玉米、大豆及其他谷类作物5.705.955.836.251.2 铜盐沉淀法测纯蛋白质 本法测定的含氮物质不包括非蛋白质物质因此通过蛋白质换算因数而得到的是纯蛋白质%试剂配制(1) 6%硫酸铜 60gCuSO45H2O溶于1L水中(2) 1.25%氢氧化钠 12.5gNaOH溶于1L水中。

(3) 浓硫酸(4) 混合催化剂 称取硫酸钾(或硫酸钠)100g,硫酸铜10g，均匀混合后研细(通过0.177mm孔径)，贮于瓶中5) 0.025—0.05mol/L硫酸标准液(6) 0.005—0.01mol/L硫酸标准液测定步骤称取1.000—2.000g经过0.42mm孔径的风干样品，于150ml烧杯中加约50ml热水，放入40—50℃的水浴上加热10min烧杯内物质还未冷时，随即加25ml16%硫酸铜溶液，然后一边搅拌，一边缓缓注入25ml1.25%氢氧化钠溶液如此形成的碱式硫酸铜［CuSO4Cu(OH)2］将使样品中的蛋白质沉淀可用石蕊试纸在烧杯中检查，溶液不应是碱性反应因为碱性反应会引起凝结的蛋白质溶解放置0.5—1h(也可放置过夜)，用倾泻法过滤，即将沉淀上部液体沿玻棒倒到漏斗中，沉淀留在烧杯中用热水洗几次，而后将沉淀不损失地移至漏斗上，并继续用热水洗至滤液遇5%氯化钡不再产生硫酸钡白色沉淀为止此时间接指示非蛋白质含氮物已被洗净将带有沉淀的漏斗在50—60℃烘干，直到失去大部分水，将滤纸及内容物从漏斗上取下，并卷成筒状，毫无损失地移入250ml开氏瓶中，用量筒加入浓硫酸20—30ml，放置2h或过夜。

加入1：10硫酸铜—硫酸钾5g，倾斜置于电炉上先用小火加热，逐渐升温(避免黑色物升于瓶外)，直至出现白色蒸气后才可加大火力使沸腾，消煮至溶液呈透明的淡绿色，再消煮30min取下凯氏瓶，冷却，用蒸馏水将消煮液一起洗入250ml容量瓶中，冷却至室温后，用水定容、摇匀吸取5—10ml待测液用半微量法测氮(含氮约0.5—1mg)用普通定氮装置时，可吸取25—50ml(含氮约10—20mg)测定同时作空白试验注释 所获蛋白质沉淀不必烘至过干，以免沉淀发脆，塞入开氏瓶时容易损失只须烘至将滤纸卷成筒状而无水分渗出即可表 各种作物收获物中蛋白质的含量范围(千重%)作物名称蛋白质%(干基)作物名称蛋白质%(鲜基)菜豆洋扁豆豌豆蚕豆大豆亚麻向日葵(种仁)棉花(种仁)花生(种仁)小麦黑麦大麦燕麦稻 (种仁)玉米小米(种仁)高梁荞麦(种仁)15.0—30.524.6—34.124.0—34.027.0—35.029.4—50.42.00—30.821.1—30.228.6—42.019.3—30.014.4—24.18.3—19.410.6—20.48.0—17.37.8—14.59.0—13.210.2—21.59.5—15.312.8—19.0马铃薯冬油菜甜菜萝卜胡萝卜洋葱大蒜菠菜芹菜蕃茄茄子辣椒南瓜黄瓜甘蓝花椰菜浆果核桃高梁叶高梁茎0.7—2.71.0—1.50.7—1.40.6—1.20.6—1.91.9—2.80.72.31.3—3.60.3—0.80.6—1.20.7—1.10.4—1.00.5—0.91.2—2.62.40.3—1.916.1—28.912.4—17.54.0—7.5。