临床医学论文-从四种生物原料中制备高纯度I型胶原的比较.doc

临床医学论文.从四种生物原料中制备高纯度I型胶原的比较作者：保毅，胡蕴玉，毕龙，孟国林，李丹，白雪东，刘民【摘要】［目的］比较从4种生物原料中制备高纯度I型胶原，以满足骨组织 工程应用的需要［方法］分别以牛皮质骨、牛跟腱、猪跟腱和猪皮为原料，采 用酸性条件下胃蛋白酶限制性酶解法提取I型胶原，并用紫外吸光度、氨基酸分 析、SDS-PAGE电泳进行鉴定，计算提取率、纯度，同时与Sigma公司产品进行 比较［结果］本法所提胶原的最大紫外光吸收波长为230nm,氨基酸分析、电 泳鉴定符合I型胶原特征牛皮质骨所提胶原纯度最高(96.12%),优于Sigma 公司产品，而牛腱胶原提取率最高(75.34%),超过常规方法［结论］限制性 酶解法可以从4种生物原料中制备高纯度、高提取率的I型胶原产品，其中以牛 皮质骨胶原最好，具有良好的应用前景关键词】I型胶原；组织工程；制备；限制性酶解法［Method］ Bovine cortical bone, bovine achilies tendon, porcine achi 1 les tendon and porcine skin were spl i t ted into pieces of 0.2-0.5 mm. After being immersed in glacial acetic acid, they were extracted with pepsin. Then the crude products were dissolved, centrifuged, dialyzed and freeze drying to prepare pure collagen type I. The final products were confirmed by absorbance, amino acid analysis and*SDS-PAGE electrophoresis comparing them wi th the products of Sigma Company.[Result] The wave length of maximum absorbance of the final products was 230 nm, and the amino acid analysis and SDS-PAGE electrophoresis confirmed that the final products were collagen type I. The purity of product extracted from bovine cortical bone was the highest (96.12%) and higher than that from Sigma Company. The extraction rate of bovine achiIles tendon collagen was the highest (75.34%).[Conclusion] Collagen type I of higher purity and higher extract ion rate can be prepared using a 1imited enzyme digestion method.And the product from bovine cortical bone is better than the others,which has a promising prospect.Key words： collagen type I; t issueengineering ; preparat ion ; 1imi ted enzymedigest ion methodI型胶原是骨基质中的主要有机成分。

随着骨组织工程技术的应用和发展, 胶原在促进细胞粘附和材料表面修饰方面的优势日益突出[1]据报道，每年 因肿瘤、创伤等各种原因所致需要骨移植的患者超过三千万[2] o由于生物骨 材料存在来源有限和免疫原性等诸多限制，需要上百万的人工骨移植产品来满足 缺口，而其中大部分产品都用胶原作为原料，由此可见，I型胶原的研究和开发 具有巨大的经济价值和社会效益由于I型胶原的特殊结构，常规化学方法提取 效果差、纯度低，难以满足实际需要本文作者采取峻性条件下胃蛋白酶限制性 酶解法，比较从4种生物原料(牛皮质骨、牛跟腱、猪跟腱、猪皮)中制备I型胶 原，并与Sigma公司I型胶原样品在生物特性等方面进行了比较1材料与方法1.1主要试剂和仪器胃蛋白酶（Amersco公司）、甲醇、氯仿、冰醋酸、NaHCO3、盐酸、NaCI、 NaOH （购自西安化学试剂厂）、I型胶原（SigmaC9879）液氮、氨基酸分析仪（日 立L-8800）.紫外分光光度仪（日立U・2001）、电泳仪（Bio-Rad）,高速离心机 （BeckmanJ25）＞冷冻干燥机（ALPHA1-2LD plus）＞深低湿冰箱（REVCO）、硬组织粉 碎机（上海飞龙仪表电器有限公司）、透析膜、次高分子量标准蛋白质（中科院上 海生化所）。

1.2胶原原料准备取新鲜牛皮质骨、牛跟腱、猪跟腱、猪皮作为原料牛皮质骨去除软组织、 骨膜、松质骨及骨髓，粉碎机粉碎至0.2-0.5mm大小骨粉，粉碎过程中加入液 氮保持温度在4 C以下取10g骨粉双蒸水洗涤，去除杂质，氯仿、甲醇（1 : 1）脱脂4h,双蒸水洗涤3次，0.6mol/L盐酸脱钙48h,双蒸水洗涤3次牛跟 腱、猪跟腱、猪皮去除软组织、脂肪后分别称取10g,粉碎机粉碎至0.2-0.5mm 大小组织块，后经NaCI浸泡5 min, NaHCO3浸泡30 min,氯仿、甲醇（1 ：1）脱 脂4 h,双蒸水洗涤3次1.3胶原提取将骨粉浸于1 mol/L醋酸，按100 : 1（骨粉：胃蛋白酶，w/w）比例加入胃蛋白酶抽提，同时将牛跟腱、猪跟腱、猪皮浸于Imol/L醋酸，按10 : l（w/w） 比例加入胃蛋白酶抽提[3] o共抽提3 d,抽提过程在4C下进行，连续搅拌 抽提后液体，10 000 g离心10 min,去除沉淀，所得上清为胶原粗提液；粗提 液中加入NaCI至浓度为10%,即有大量白色沉淀析出，静置30 min； 15 000 g 离心15 min,弃上清，沉淀为粗提胶原；粗提胶原复溶到0.5 mol/L醋酸中， 过滤去除不溶杂质，10倍体积双蒸水半透膜透析24 h,每8 h换水1次；透析 后所得即为精制胶原液，冻干机冻干保存。

1.4胶原鉴定1.4.1紫外分光光度计检测胶原吸收峰取以上4种胶原0.5%溶液，采用日立U-2001型紫外分光光度仪在200 nm〜 450 nm波长范围内，以10 nm的间距进行扫描，测定样品最大紫外吸收峰的波 长1.4.2胶原氨基酸分析取以上4种胶原样品0.3g经6mol/L盐酸水解为游离氨基酸,经日立L-8800 氨基酸分析仪离子交换色谱柱分离后，与前三酮溶液产生颜色反应，再通过分光 光度计比色，测定氨基峻含量所得结果同I型胶原样品（Sigma公司）进行比对 分析1.4.3 SDS-PAGE电泳检测胶原蛋白分子量把以上4种胶原配制浓度为1 ug/u 1的样品溶液，进行SDS・PAGE电泳 每次上样量15 u L以次高分子量标准蛋白为Marker,用5%的浓缩胶，8% 的分离胶，电压分别为浓缩胶80 V,分离胶140 V,电泳120 mine1.5.1提取率测定每次取4种生物原料（牛皮质骨、牛跟腱、猪跟腱、猪皮）各10 g进行胶原 提取，测定每次冻干后纯化胶原的质量，重复5次，并通过以下公式计算胶原提 取率胶原提取率：5次纯化胶原质量之和 5次生物原料质量之和X 100%1.5.2羟脯氨酸含量测定（Worcssncr法：4］）标准曲线绘制：称取羟脯氨酸标准品，溶于0.001 mol/L盐酸，按比例稀释 成梯度溶液：12.5、25、50、75、100 mg/ml。

取2 ml梯度溶液加入1.4%氯 胺T溶液1 ml混合，室温下静置20 min,加入18.9%过氯酸溶液1 ml,室温 下静置5 min,加入20%对二甲基苯甲醛溶液1ml, 60 C加热20 min,冷却后, 测定560 rnn处吸光度统计学软件SPSS 10.0分析浓度和吸光度间关系，计算 相关公式、相关系数并拟和标准曲线取以上4种胶原各0.40 g与6mol/L盐酸按1 : 100（w/v）混合，110 C加 热水解24 h,水解后除去盐酸，残渣溶于双蒸水制成样品液重复上述处理测 定560 nm吸光度，并根据公式计算样品中羟脯氨酸含量1.5.3纯度计算根据文献报道［5］,通过下面公式计算胶原纯度胶原纯度：羟脯氨酸含量 胶原样品量X 100%将本实验所制备4种胶原和I型胶原样品（Sigma公司）进行蛋白含量、胶原 纯度的比较2结果2.1紫外分光光度计检测胶原吸收峰经测定4种胶原最大紫外光吸收波长均在230 nm,形成一•个较陡峭的峰， 符合胶原蛋白特殊吸收峰波长位置，与文献报道的I型胶原特征相符［6］2.2胶原氨基酸分析氨基酸分析结果显示：所提4种胶原与sigma I型胶原在氨基酸组成上较相 似，其中甘氨酸含量在30%左右，脯氨酸含量12%左右，含硫氨基酸（胱氨酸、 蛋氨酸）含量较低，不含色氨酸（表1）。

表1胶原氨基酸分析结果2.3 SDS・PAGE 电泳4种样品SDS・PAGE电泳显示3条明显条带，分子量大约是21.54X10-23kg（两条）和109.36X 10-24 kg （一，条）kDa,符合文献报道的I型胶原蛋白分子 2条Q 1 （ I ）链和1条Q 2（ I ）链的组成特征2.4提取率测定本实验所提4种I型胶原样本的蛋白提取率，其中牛腱的提取率最高（75.34%）,猪腱、猪皮的提取率其次，骨粉的提取率最低（6.24%）（表2）表2四种胶原的蛋白提取率2.5羟脯氨酸标准曲线的绘制(图1)羟脯氨酸标准曲线，其线性回归方程为A=0.0081P+0.3233,相关系数R2=0.9485o说明该曲线的羟脯氨酸浓度和吸光度相关性好图1羟脯氨酸标准曲线2.6纯度计算根据测出的羟脯氨酸含量计算的四种I型胶原样本的纯度结果见表3,其结 果显示经牛皮质骨所提胶原的纯度最高(96.12%),其次为牛腱(87.50%),而猪 皮所提胶原含量则较低(76.25%)表3胶原纯度3讨论组织工程的发展得益于种子细胞、细胞因子和支架材料各方面的全面发展而在骨组织工程的各个方面I型胶原都展现出其独特优点［7］。

I型胶原作为骨基质中含量最多的天然大分子物质，与骨的天然结构最接近，同时其种属特 异性不强、抗原性低、亲水性好、生物兼容性好等优点都使它在人工合成支架材 料的改性［8］、细胞三维培养、细胞因子载药微球以及缓释技术等方面有着广泛的应用：9］ o文献报道胶原在骨组织工程特别是人工骨组织工程方面应用较 多的是表面修饰和改性作用：种子细胞对支架材料的粘附主要是通过细胞表面特 异性整合素受体与材料中相应的配体结合而实现，单纯聚酯材料或无机支架缺乏 此类配体，难以实现种子细胞的有效粘附；而I型胶原含有的特异性高效识别RGD(精氨酸.甘氨酸.天冬氨酸)肽序列恰恰具有整合素配体的特点，因而用其修 饰能够增加细胞对支架材料的粘附，促进细胞的增殖和分化I型胶原制备的方法常规分为两大类一类是利用基因重组合技术人工合成 胶原，此类方法可以得到较高纯度的胶原产品，重复性好且质量稳定，但其成本 高，工艺复杂，不利于推广另一类是利用峻、碱、盐等化学物质从天然组织中 提取胶原，此类方法工艺简便，成本低，但。