第六章 组织培养灭菌及接种移栽操作技术.ppt

第六章 操作技术教学目标： 熟练掌握组织培养相关的灭菌消毒方 法和无菌操作技术；掌握培养和驯化 移栽的方法步骤；理解灭菌和消毒的 区别 第六章 操作技术教学内容： ◇培养基的制备技术 ◇灭菌技术 ◇接种材料的选择与预处理 ◇接种 ◇培养 ◇移栽驯化第一节 培养基制备技术1.母液配制与保存2.培养基的配制确定培养基称量计算溶解分装定容贴标签保存一、母液制备流程图母液Ⅰ mg/L 20x 称量1、 NH4NO3 1650 33000 33g2、 KNO3 1900 38000 38g 3、 CaCL2·2H2O 440 8800 8.8g 4、MgSO4·7H2O 370 7400 7.4g 5、KH2PO4 170 3400 3.4g标签将1、2、4、5 、按称量称好放 入烧杯甲溶解；将3、称后放入 烧杯乙溶解；再混合定溶至1 升溶液，放入试 剂瓶中备用。

烧杯甲烧杯乙试剂瓶MS大量元素50ml/L 2005.4.5标签培养基母液配制（以MS为例）：mg/L 1000x 称量1、KI 0.83 830 0.832、H3BO3 6.2 6200 6.23、MnSO4.4H2O 22.3 22300 22.34、ZnSO4.7H2O 8.6 8600 8.65、Na2MoO4.H2O 0.25 250 0.256、CuSO4.5H2O 0.025 25 0.0257、CoCL2.6H2O 0.025 25 0.025标签烧杯试剂瓶以上七项按‘称量’ 称重，放烧杯中溶 解后定溶至1升，放 试剂瓶中备用MS微量元素1ml/L 2005.4.5标签母液Ⅱ Mg/L 200x 称量1、FeSO4.7H2O 27.8 5560 5.56g2、Na2.EDTA.2H2O 37.3 7460 7.46g将1、2、分别称重 后，分别溶 解、再混和 定溶至1升，放试剂瓶 中备用。

标签烧杯甲烧杯乙试剂瓶MS铁盐5ml/L2005.4.5标签母液Ⅲ（铁盐）mg/L 1000x 称量1、烟酸 0.5 500 0.5g2、B6 0.5 500 0.5g3、B1 0.1 100 0.1g4、甘氨酸 2 2000 2g上列四种按‘称量’称重后溶解，定 溶至1升，放试剂瓶中备用标签烧杯试剂瓶MS有机元素1ml/L2005.4.5标签母液Ⅳ母液Ⅴ（肌醇）mg/L 200x 称量 肌醇 100 20000 20g将肌醇按‘称量 ’称重后，放烧杯 中溶解定溶至1升 ，置试剂瓶中备用 标签烧杯试剂瓶MS肌醇5ml/L2005.4.5 标签植物激素母液配制：常用植物激素有生长素、细胞分裂素、赤霉素等一般按 1mg/1ml浓度配制；使用时1ml/L即为1ppm生长素类：IAA、 NAA、 2,4-D、IBA生长素类配制时，先按要求浓 度称好药品置小烧杯中，用 1－ 2ml0.1NNaOH溶解，再加蒸馏水定 溶至所需浓度，再置滴瓶中备用生长素1mg/ml2005.4.5滴瓶标签细胞分裂素类：6-BA、KT、ZT配制细胞分裂素时宜先用0.5N盐酸 溶解再加蒸馏水至所需浓度。

赤霉素在水中分解，可溶于甲醇、 乙醇中GA3在水中不稳定，用95％ 乙醇培成母液备用标签烧杯移母液 调PH值 培养基熬制 灭 菌称取蔗糖、琼脂 扎 口 定 容 分 装 二次定容接 种确定配方二、培养基制备移母液 调PH值 培养基熬制 灭 菌称取蔗糖、琼脂 扎 口 定 容 分 装 二次定容接 种确定配方4.培养基制备培养基配制（以1升培养基为例）：Ⅴ母液 母液 Ⅱ母液母液母液 ⅠⅢⅣ分装筒1、将母液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、 Ⅴ按标签取量加进分装筒2、取琼脂7－10g，放钢精锅 中，煮溶后加蔗糖30g,溶解后 倒入分装筒定溶至1升3、按需要加植物激素后，用 1NNaOH或盐酸调pH5.8,分装 瓶口塞上棉塞并用牛皮纸包扎 好，放入高压灭菌锅中灭菌钢精锅琼脂、蔗糖4、在分装容器，灭菌后的培养基可在室温下储存（最适宜的温度为10℃）， 并在2周内用完第二节 灭菌技术1.灭菌与消毒的区别2.环境灭菌3.培养基的灭菌4.培养用品及器具等的消毒灭菌5.接种材料的消毒灭菌• 消毒：杀死、消除或抑制部分微生 物，使之不发生作用•灭菌：用理化方法杀死物体表面和孔 隙内一切微生物或生物体。

思考：灭菌和消毒有何区别？1.灭菌与消毒的区别2.环境灭菌◆培养室灭菌◆接种室灭菌接种室灭菌方法◆接种台喷雾消毒：70%酒精 ；0.1%新洁尔灭◆紫外灯照射：波长260nm，距离小于 1.2m，20-30min◆臭氧灭菌机：1-2h◆熏蒸灭菌：5-8ml/m3甲醛 +5g/m3 高锰酸钾；冰醋酸加 热培养室灭菌方法 ◆新建培养室用前一定要彻底熏蒸1次 方法与接种室同 ◆隔2-5d用洗衣粉水或3%来苏水拖地1次 ，用0.1-1.0%高锰酸钾液擦架1次 3.培养基灭菌 ◆高压湿热灭菌 ◆某些激素（IAA） 、维生素、氨基酸（谷氨酰胺）采用过滤 灭菌1.外桶 2.锅盖 3.安全阀 4.排气阀 5.气压表 6.内桶 7.排气软管 8.支架 手提式高压湿热灭菌锅手提式高压湿热灭菌方法装锅加水封盖通电加热排冷空气升温保压断电降压出锅冷却自动高压湿热灭菌锅电源水位指示灯温度、压力显示窗 温度压力设置钮压力表放汽阀装锅加水封外盖升温排冷气升温保压降压出锅冷却自动高压湿热灭菌方法通电设置参数封内盖培养基高压灭菌所必需的最少时间 容器体积积 (mL) 121℃灭灭菌所需最少时间时间 (min) 20-5015 75-150 20 250-500 25 100030一般为：120℃，1.1公斤/厘米2的高压下灭菌15－20分钟。

过滤灭菌 滤膜Ø0.45um 以下1.过滤器先灭菌，灭菌 温度不超过121℃ 2.溶液先进行初滤(滤膜 Ø0.65um)4.培养用品及器具等的灭菌消 毒方法玻璃器皿灭菌 接种工具灭菌 实验服、口罩、滤纸灭菌 物体表面灭菌玻璃器皿及量具的清洗消毒 玻璃器皿灭菌 ◆干热灭菌：160-180℃,1.5-2.0h ◆湿热灭菌：121℃, 20-40min ◆接种前用酒精棉球擦试消毒，并在 酒精灯火焰上灼烧灭菌接种工具灭菌 ◆用前干热灭菌：160-180℃,1.5-2.0h ◆用前湿热灭菌：121℃, 20-30min ◆接种前用酒精棉球擦试，浸入95%酒精 液中，并灼烧灭菌◆湿热灭菌：121℃,20-30min ◆实验服灭菌后置于缓冲间或密封好 实验服、口罩、滤纸灭菌 物体表面灭菌◆灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌 ◆消毒剂：70%酒精；1-2%来苏水； 0.25-1%新洁尔灭；洗衣粉；吐温-80◆应用：桌面、墙面、双手、材料表面玻璃器皿及量具的清洗与消毒1.洗涤场所及用具：场所：洗涤室 用品：水池 塑料盆 塑料桶、三孔 鹅颈式水龙头，下水用过滤网，各种 规格刷子。

2.洗涤液： 洗衣粉 洗洁精 高锰酸钾 稀盐酸 重铬酸钾+浓硫酸混合液 3.洗涤方法：◇新购玻璃器皿清洗方法： ①先用1%稀盐酸洗后用洗衣粉清洗 ，用自来水或蒸馏水冲洗②用重铬酸钾+浓硫酸洗液浸泡4h后 ，自来水彻底冲洗3.洗涤方法： ◇用过的玻璃器皿清洗： 流水冲洗后，泡入洗衣粉水中刷洗， 后用自来水冲洗或在清水中漂洗 ◇污染瓶清洗： 用0.1%kmno4液洗涤或高压灭菌后在 洗衣粉中浸泡，再用自来水冲洗5.注意事项： ①瓶口要清洗干净 ②培养瓶上的标记要擦净 ③冬季，用热水溶解洗衣粉后再洗 ④洗过玻璃器皿要沥干或烘干 ⑤移液管之类的量具和计量仪器不宜烘烤 4.洗涤标准： 透明锃亮，内外壁水膜均一，不挂 水 珠◇移液管清洗： 在溶化的洗衣粉水中吸洗，再用流水 冲洗或用95%酒精吸弃数次洗净后 倒放，垂直晾干为了保证组培实验成功，接种材料接种前 必需消毒因为植物材料表面常常带有各种 微生物，一旦带入，就会迅速滋生，使实验 前功尽弃消毒的原则：杀死微生物而不伤及材料污染的种类：细菌性污染 真菌性污染5.接种材料的消毒灭菌◆消毒灭菌步骤◆化学灭菌 ◆常用化学灭菌剂常用灭菌剂的使用浓度与效果比较灭菌剂 使用浓度 持续时间 去除难易 效 果 次氯酸钙 9-10%5-30min 易 很好 次氯酸钠 2% 5-30min 易 很好 氯化汞 0.1-1% 5-8min 较难 最好抗菌素 4-50mg/L 30-60min 中 较好 接种材料修剪与表面消毒灭菌①外植体清洗（三次）：用流水冲洗或洗衣粉漂洗 ； ②用化学灭菌剂浸润灭菌，最好加吐温-80等 表面活性剂(灭菌液的0.5%)，一般70%酒精5 －30S，0.1-1%升汞5-8 min； ③无菌水冲洗3-10次。

注：灭菌液要浸没材料接种材料表面消毒灭菌步骤:1.外植体的选择(1)根据培养目的选择(2)考虑种质、取材大小、时期和材料 的生理状态，具有代表性第三节 外植体的选择与预处理 幼嫩 茎尖营养芽◆选择优良的种质◆选择健壮无病虫害的植株◆选择最适时期◆选择适宜大小 2.接种材料预处理(1)接种材料预培养(2)就地套袋(3)接种材料修整 与冲洗接种材料修整与冲洗第四节 接种◆接种程序◆无菌操作规程接种程序（广义）7.外植 体 移入培养基1.培养材料选择2.接种材料预处理3.接种环境灭菌4.培养基制备与工 具灭菌5.材料表面灭菌6.外植体切割 5.材料表面灭菌1.叶片0.5cm×0.5cm2.微茎尖0.2-0.5mm3.带节茎段0.5-1.0cm6.外植体切割4.芽丛分离7.外植体接入培养基 接种方法D关紫外灯，开日光灯及风机，擦双手及台面E擦拭接种工具并反复灼烧， 烘烤培养皿F接种完，清理台面并标识B接种前20min打开紫外灯C接种员洗手，在缓冲间换鞋、穿好实验服A接种前4h接种室灭菌 无菌操作规程复习思考题： 1.比较灭菌和消毒的区别 2.理解无菌操作对植物组培的重要意义 3.组培各环节灭菌可以采用哪些灭菌方法？ 4.保谓接种和无菌操作规程？说明组培接种 程序是怎样的？案例式讨论 总结复习提问：1.概括说明接种材料表面灭菌的一般 步骤？ 2.接种室和培养室灭菌方法有哪些？ 3.组培无菌操作有何要求？ 1.培养含义 2.培养方法 3.培养步骤 4.外植体成苗途径第五节 培养将植物材料经培养， 使之生长，分裂分化 形成愈伤组织、芽、 胚状体、原球茎,进一 步分化成再生植株或 产生代谢产物的过程 。

一、培养含义通气性较好，便于 操作，但营养分布 不均，生长发育不 一致。