土壤酶活性测定方法.doc

土壤蛋白酶活性测定方法：铜盐比色法（一）方法原理本法基于以精胶为基质，酶解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复合物用比色测定颜色深度，计算出氨基酸含量，来度量酶的活性二）试剂1）1%精胶2）甲苯3）铜-磷酸盐溶液：①27.3gCuCl2・H2O溶于1L水；②64.5gNa2HPO4・12H2O溶于500mL水，加入7.2gNaOH,稀释至1L；③57.21gNa2B4O7溶于1.5L水，加入100毫升0.1mol/LHCL稀释至2L,使用按照1：2：2的体积分数前将上述①、②、③混合4）甘氨酸标准溶液的配制：取267.9mg甘氨酸溶于蒸馏水，稀释至1L（1mL含50pgNH3-N）三）操作步骤（1）标准曲线绘制取0、5、10、15、20mL甘氨酸标准溶液，用蒸馏水加至20mL,然后加入20mL新配制的铜-磷酸盐溶液显色后，用分光光度计在650nm处测定，绘制标准曲线2）土壤蛋白酶活性测定称取5g土壤置于100mL三角瓶中，加入甲苯2mL，放置15min,加入20mL1%精胶溶液，于37°C恒温培养24h，于此同时，以水代替基质作为对照培养结束后，将悬液过滤，取10mL滤液，加水10mL，铜-磷酸盐溶液20mL。

显色后，用分光光度计在650nm处测定，根据标准曲线求出NH3-N含量以每克土壤在37C下24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量（pg）表示蛋白酶活性土壤蔗糖酶测定方法：3,5-二硝基水杨酸比色法分析意义：对增加土壤中易溶性营养物质起着重要作用，蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高一）方法原理蔗糖酶酶解所生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性二）试剂1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.876gNa2HPO4・2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml力口1/15M磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成，甲苯2）葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80°C烘箱内约12小时准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4C保存期约一星期）若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。

3）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（保存期不过7天）（三）测定步骤（1）标准曲线绘制分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线2）土壤蔗糖酶测定称取5g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml8%蔗糖溶液，5mlpH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯摇匀混合物后，放入恒温箱，在37C下培养24h到时取出,迅速过滤从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3mlDNS试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于508nm处进行比色为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。

3）结果计算葡萄糖（毫克）=aX4式中，a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数4换算成1g土的系数纤维素酶分析意义：纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶分析方法：硝基水杨酸比色法试剂：1%羧甲基纤维素溶液,pH5.5磷酸盐缓冲液：由0.06MKH2PO4和Na2HPO4溶液混合制成，甲苯，3,5-二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（保存期不过7天），葡萄糖标准溶液：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0,0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线操作步骤：称10g土壤置于50ml三角瓶中，力口20ml1%羧甲基纤维素溶液、5mlpH5.5磷酸盐缓冲液及1.5ml甲苯，将三角瓶放在37°C恒温箱中培养72h。

培养结束后，过滤并定容25ml取1ml滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定每一实验处理均应设置以5ml水代替DNS基质的对照，为检验试剂纯度应设无土壤的对照纤维素酶活性以72h，10g土壤生成葡萄糖毫克数表示。