6进化酶酶工程与蛋白质工程教学课件.ppt

第六章第六章 蛋白质分子的定向进化蛋白质分子的定向进化 蛋白质分子定向进化的原理蛋白质分子定向进化的原理 蛋白质分子定向进化的策略蛋白质分子定向进化的策略 蛋白质分子定向进化的应用蛋白质分子定向进化的应用对蛋白质分子的改造主要包括对蛋白质分子的改造主要包括2 2个方面：个方面：•蛋白质分子的合理设计蛋白质分子的合理设计: :化学修饰，化学修饰，定点突变定点突变•蛋白质分子的非合理设计蛋白质分子的非合理设计：定向进化：定向进化一、蛋白质分子定向进化的原理一、蛋白质分子定向进化的原理 所谓蛋白质分子的体外定向进化，又称所谓蛋白质分子的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解蛋白质分子的空间结构和催它不需事先了解蛋白质分子的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制自然进化机制( (随机突变、重组和自然选择随机突变、重组和自然选择) )，在体外改造蛋白质基因，并定向选择出所，在体外改造蛋白质基因，并定向选择出所需性质的突变蛋白质分子需性质的突变蛋白质分子。

 理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件向进化的基本先决条件 体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为蛋白质分子的理设计所不能解决的问题，为蛋白质分子的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且在结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力定向进化定向进化 = = 随机突变随机突变 + + 选择选择 前者是人为引发的，后者虽相当于环境，前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的个进化过程完全是在人为控制下进行的二、蛋白质分子定向进化的策略二、蛋白质分子定向进化的策略 定向进化是由一个靶基因或一群相关的定向进化是由一个靶基因或一群相关的家族基因起始创建分子多样性家族基因起始创建分子多样性( (突变和突变和/ /或或重组重组) )文库，然后对该多样性文库的基因文库，然后对该多样性文库的基因产物进行筛选，那些编码改进功能产物的产物进行筛选，那些编码改进功能产物的基因被利用来继续下一轮进化；重复这个基因被利用来继续下一轮进化；重复这个过程直到达到目标。

过程直到达到目标Directed evolution1、突变文库的建立、突变文库的建立易错易错PCRPCR( (Error Prone PCR) ) 采用采用TaqTaq酶进行酶进行PCRPCR扩增目的基因时，通过调扩增目的基因时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度，加入锰离子，整反应条件，如提高镁离子浓度，加入锰离子，改变体系中四种改变体系中四种dNTPdNTP的浓度等，改变的浓度等，改变TaqTaq酶的突酶的突变频率，从而向目的基因中引入随机突变，构变频率，从而向目的基因中引入随机突变，构建突变体库并从中选择或筛选所需要的突变体建突变体库并从中选择或筛选所需要的突变体 连续易错连续易错PCRPCR是将一次是将一次PCRPCR扩增得到的有用突扩增得到的有用突变基因作为下一次变基因作为下一次PCRPCR扩增的模板，连续反复地扩增的模板，连续反复地进行随机诱变进行随机诱变 DNA改组改组 (DNA shuffling) DNADNA改组改组是对一组同源基因进行体外随机重组是对一组同源基因进行体外随机重组的特殊的特殊PCRPCR技术，又称为基因洗牌术。

技术，又称为基因洗牌术 先采用先采用DNaseIDNaseI消化不同来源的的同源消化不同来源的的同源DNADNA，接，接着将这些小片断进行无引物的着将这些小片断进行无引物的PCRPCR扩增，在此过扩增，在此过程中，随机片断之间互为模板和引物进行扩增，程中，随机片断之间互为模板和引物进行扩增，直到获得全长基因，形成突变文库通过筛选直到获得全长基因，形成突变文库通过筛选程序获得较理想的突变基因样本，作为下一轮程序获得较理想的突变基因样本，作为下一轮DNADNA改组的模板，重复直至获得性状满意的突变改组的模板，重复直至获得性状满意的突变基因1.DNaseI产生随机片段；产生随机片段；2.2. 随机片段变性；随机片段变性；3.3. 随机片段复性；随机片段复性；4.4. 延伸延伸 反复重复反复重复2-4步后，可获得全长步后，可获得全长DNA片片段段 体外随机重组法体外随机重组法(RPR) 体外随机引发重组体外随机引发重组(random priming in (random priming in vitro recombination, RPR)vitro recombination, RPR)以单链以单链DNADNA为模为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短补于模板不同位点的短DNADNA片段，由于碱基的片段，由于碱基的错配和错配和 错误引发，这些短错误引发，这些短DNADNA片断中也会有片断中也会有少量的点突变。

在随后的少量的点突变在随后的PCRPCR反应中，它们互反应中，它们互为引物，合成出较长的片断，最终组装成完为引物，合成出较长的片断，最终组装成完整的基因长度，形成基因多样性文库整的基因长度，形成基因多样性文库交错延伸法交错延伸法(StEP)交错延伸交错延伸( (staggered extension process, StEP) )是是一种简化的一种简化的DNADNA改组技术，它不是由短片段组改组技术，它不是由短片段组装全长基因，而是在装全长基因，而是在PCRPCR反应中，将含不同点反应中，将含不同点突变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂复突变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂复性及延伸反应，在每一轮中，那些部分延伸的性及延伸反应，在每一轮中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，如此重复直至获得全长基因片段，结构产组，如此重复直至获得全长基因片段，结构产生相间的含不同模板序列的新生生相间的含不同模板序列的新生DNADNA分子过渡模板随机嵌合生长过渡模板随机嵌合生长(RACHITT)渐增切割法产生杂和酶渐增切割法产生杂和酶Incremental Truncation for Creation of Hybrid Enzyme, ITCHE 用核酸外切酶用核酸外切酶IIIIII分别消化两个非高度同源的分别消化两个非高度同源的靶基因，控制切割速度不大于靶基因，控制切割速度不大于10bp/min10bp/min，每隔，每隔很短时间连续取样，迅速终止样品反应，以获很短时间连续取样，迅速终止样品反应，以获得一组一次有几个甚至一个得一组一次有几个甚至一个bpbp缺失的片断，然缺失的片断，然后将来自两个靶基因的片断随机混合，产生杂后将来自两个靶基因的片断随机混合，产生杂和基因文库，表达该文库，通过酶活测定筛选和基因文库，表达该文库，通过酶活测定筛选出理想的重组杂和基因。

出理想的重组杂和基因不依赖于不依赖于DNADNA序列序列同源性的随机重同源性的随机重组文库的构建组文库的构建同源序列非依赖性蛋白质重组同源序列非依赖性蛋白质重组（（sequence homology independent protein recombination, SHIPRE）） 将将2 2个靶基因串联在同一载体上；个靶基因串联在同一载体上；PCRPCR将将α–α–硫代磷酸核苷酸随机掺入到扩增产物硫代磷酸核苷酸随机掺入到扩增产物中；用核酸外切酶中；用核酸外切酶IIIIII处理产生不同截短程处理产生不同截短程度的度的DNADNA片断，通过琼脂糖电泳回收与靶基片断，通过琼脂糖电泳回收与靶基因长度相似的随机片断，与表达载体连接因长度相似的随机片断，与表达载体连接重组，转化受体细胞，形成表达型杂和蛋重组，转化受体细胞，形成表达型杂和蛋白文库§ 表型观察选择和筛选表型观察选择和筛选: :基于细胞生长率和生基于细胞生长率和生存率的筛选方法；或是基于蛋白质突变体库中酶的催化活存率的筛选方法；或是基于蛋白质突变体库中酶的催化活性的筛选方法，主要依据强发色体底物性的筛选方法，主要依据强发色体底物( (颜色变化颜色变化) )、易观、易观察的克隆表现察的克隆表现( (溶解圈溶解圈) )或荧光产物来筛选突变体。

或荧光产物来筛选突变体 § 高通量筛选蛋白质突变体库的方法：高通量筛选蛋白质突变体库的方法：如表面展示技术如表面展示技术2、突变文库的筛选、突变文库的筛选噬菌体表面展示技术噬菌体表面展示技术Phage display techniques 将目的基因克隆在丝状噬菌体衣壳蛋将目的基因克隆在丝状噬菌体衣壳蛋白的基因中，使外源基因产物与衣壳蛋白白的基因中，使外源基因产物与衣壳蛋白融合，伸展在噬菌体表面，可用来直接检融合，伸展在噬菌体表面，可用来直接检测表达产物的某些活性，从而实现基因型测表达产物的某些活性，从而实现基因型和表型的转换，提供了高效率的筛选系统，和表型的转换，提供了高效率的筛选系统，广泛应用于基础和应用研究广泛应用于基础和应用研究基于三个原则：基于三个原则：(1)(1)在在pⅢpⅢ和和pⅧpⅧ衣壳蛋白的衣壳蛋白的N N端插入外源基因，形成的端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响噬菌体的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响噬菌体的生活周期，同时保持的外源基因天然构象，也能被相生活周期，同时保持的外源基因天然构象，也能被相应的抗体或受体所识别应的抗体或受体所识别(2)(2)利用固定与固相支持物的靶分子，采用适当的淘利用固定与固相支持物的靶分子，采用适当的淘洗洗(panning)(panning)方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体出目的噬菌体(3)(3)外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链体的单链DNADNA测序推导出来，实现了基因型和表型的测序推导出来，实现了基因型和表型的转换转换 在蛋白质工程中的应用：在蛋白质工程中的应用： 将通过易错将通过易错PCRPCR、、DNADNA改组等方法产生蛋白质改组等方法产生蛋白质或结构域的突变文库呈现在噬菌体表面，通过或结构域的突变文库呈现在噬菌体表面，通过亲和筛选获得所需的已定向改变的噬菌体克隆，亲和筛选获得所需的已定向改变的噬菌体克隆，其一级结构可以从其一级结构可以从DNADNA的序列中推导出来，可的序列中推导出来，可用来筛选具有更强受体结合能力的细胞因子、用来筛选具有更强受体结合能力的细胞因子、新的酶抑制剂、转录因子的新的酶抑制剂、转录因子的DNADNA结合新位点、结合新位点、新的细胞因子拮抗剂、新型酶和增强生物学活新的细胞因子拮抗剂、新型酶和增强生物学活性的蛋白质等。

性的蛋白质等 核糖体展示技术是一种完全在体外合成蛋白质分核糖体展示技术是一种完全在体外合成蛋白质分子并进行选择与进化的技术基本原理是通过子并进行选择与进化的技术基本原理是通过PCRPCR扩扩增目的基因的增目的基因的DNADNA文库，同时加入启动子、核糖体结文库，同时加入启动子、核糖体结合位点等合位点等，，并置于具有转录并置于具有转录/ /翻译翻译耦联耦联的无细胞翻译的无细胞翻译系统中孵育，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表系统中孵育，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面，形成面，形成mRNAmRNA- -蛋白质蛋白质- -核糖体核糖体三元复合体，最后利用三元复合体，最后利用常规的免疫学检测技术，通过固相化的靶分子直接从常规的免疫学检测技术，通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再利用RT-PCRRT-PCR扩增，进行下一循环的富集和选择，最终筛选扩增，进行下一循环的富集和选择，最终筛选出高亲和力的目标分子出高亲和力的目标分子核糖体展示核糖体展示Ribosomal Display, RD核糖体展示核糖体展示mRNA展示技术展示技术 在在mRNAmRNA的的3’3’末端连入一个嘌呤霉素末端连入一个嘌呤霉素标记的标记的DNA linkerDNA linker片段片段, ,体外翻译时核糖体外翻译时核糖体会停在体会停在DNA linkerDNA linker与与RNARNA之间的连接处之间的连接处, ,嘌呤霉素进入核糖体嘌呤霉素进入核糖体A A位点位点, ,并在肽酰转移并在肽酰转移酶的作用下与天然多肽偶联。

酶的作用下与天然多肽偶联多肽多肽- -嘌呤嘌呤霉素霉素-mRNA-mRNA复合物复合物与核糖体解离后与核糖体解离后, ,直接用直接用于亲和性筛选于亲和性筛选 核糖体展示技术与核糖体展示技术与mRNA-mRNA-多肽融合技术基本原多肽融合技术基本原理类似理类似, ,只是后者利用了嘌呤霉素将只是后者利用了嘌呤霉素将mRNAmRNA与多肽以与多肽以共价键的形式联系起来共价键的形式联系起来, ,从而避免了核糖体展示中从而避免了核糖体展示中因缺少稳定的共价键使得核糖体三元复合物不够因缺少稳定的共价键使得核糖体三元复合物不够稳定的问题稳定的问题; ;另外另外mRNA-mRNA-核糖体核糖体- -多肽三元复合物中多肽三元复合物中的核糖体由于分子量较大可能会影响靶标蛋白的的核糖体由于分子量较大可能会影响靶标蛋白的筛选筛选, ,导致高亲和力靶标分子的丢失导致高亲和力靶标分子的丢失, ,而而mRNA-mRNA-融合融合技术避免了此类问题技术避免了此类问题, ,更适合于严谨条件下更适合于严谨条件下( (如高如高温温) ) 靶标分子的筛选靶标分子的筛选 与噬菌体展示技术相比较，核糖体和与噬菌体展示技术相比较，核糖体和mRNAmRNA展示技术不需要将展示技术不需要将DNADNA库转化到微生物中，库转化到微生物中，因此，库容量的大小不受转化效率的限制，因此，库容量的大小不受转化效率的限制，库容量比噬菌体肽库高几个数量级。

但是，库容量比噬菌体肽库高几个数量级但是，核糖体展示和核糖体展示和mRNAmRNA多肽融合技术都需要绝大多肽融合技术都需要绝大多数核糖体能将蛋白质翻译完全，以使其能多数核糖体能将蛋白质翻译完全，以使其能够正确折叠够正确折叠, ,这是筛选成功的关键之一这是筛选成功的关键之一 细菌表面展示细菌表面展示 细菌表面展示技术是利用基因工程手细菌表面展示技术是利用基因工程手段将某一蛋白质或短肽段段将某一蛋白质或短肽段( (靶蛋白靶蛋白) )与细菌与细菌外膜蛋白外膜蛋白( (载体蛋白载体蛋白) )以融合蛋白的形式呈以融合蛋白的形式呈现在细胞表面现在细胞表面外源蛋白与载体蛋白序列融合方式：外源蛋白与载体蛋白序列融合方式：C C端融合端融合，如脂蛋白，如脂蛋白- -外膜蛋白外膜蛋白A(Lpp-OmpA)A(Lpp-OmpA)系统，系统，其其OmpAOmpA的的N N端锚定在外膜；端锚定在外膜；N N端融合端融合，如免疫球蛋白，如免疫球蛋白A A蛋白酶家族中的一些成蛋白酶家族中的一些成员含有自动转运结构，其员含有自动转运结构，其C C端锚定在细胞外膜，适端锚定在细胞外膜，适于于N N端融合；端融合；夹心融合夹心融合，如麦芽糖孔蛋白，如麦芽糖孔蛋白(Lamb)(Lamb)本身具有信号本身具有信号肽序列及锚定于外膜的序列，在其内部合适位点肽序列及锚定于外膜的序列，在其内部合适位点插入外源蛋白，可实现细胞表面展示。

插入外源蛋白，可实现细胞表面展示OmpAOmpA是革兰氏阴性菌的主要外膜蛋白之一是革兰氏阴性菌的主要外膜蛋白之一, , 由由325325个氨个氨基酸残基组成，通过基酸残基组成，通过ββ折叠跨膜折叠跨膜8 8次次, ,形成形成4 4个朝向膜外个朝向膜外的的loop,loop,在在L2L2、、L3L3、、L4L4中插入外源基因都能获得表面表中插入外源基因都能获得表面表达；达；IgAIgA蛋白酶蛋白酶是致病性革兰氏阴性菌淋病奈瑟球菌的一种是致病性革兰氏阴性菌淋病奈瑟球菌的一种分泌性酶分泌性酶, ,其分泌机制需要其分泌机制需要C C末端的参与，末端的参与，N N端含有特异端含有特异性的信号肽辅助其穿越内膜性的信号肽辅助其穿越内膜,C,C末端末端能整合在细菌外膜能整合在细菌外膜上上, ,中间部分为中间部分为IgAIgA蛋白酶的功能区蛋白酶的功能区，将外源基因取代，将外源基因取代该区域可实现表面呈现；该区域可实现表面呈现；LamBLamB是革兰氏阴性菌外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜蛋白PorinPorin家族成员，其三维家族成员，其三维结构显示结构显示Loop9(Loop9(第第375-405375-405位氨基酸位氨基酸) )是暴露的最大的是暴露的最大的环，适于外源蛋白插入。

环，适于外源蛋白插入革兰氏阳性菌表面展示系统革兰氏阳性菌表面展示系统葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A A（（SpASpA）由信号肽、）由信号肽、IgGIgG结合结合区和区和C C末端的表面结合区组成葡萄球菌表末端的表面结合区组成葡萄球菌表面呈现系统是利用面呈现系统是利用SpASpA的的C C末端锚定区末端锚定区, ,用外用外源蛋白取代源蛋白取代IgGIgG结合区片段，基因以质粒形结合区片段，基因以质粒形式存在于宿主细胞内，融合蛋白表达并呈式存在于宿主细胞内，融合蛋白表达并呈现在细菌表面现在细菌表面Pro- and eukaryotic surface display systems  细菌细胞表面展示技术，结合细菌细胞表面展示技术，结合荧光激活细胞筛选仪荧光激活细胞筛选仪( (Fluorescence Activated Cell Sorting，FACS) )或或流式细胞筛选仪流式细胞筛选仪( (Flow cytometry) )是非常有效的高是非常有效的高通量筛选方法此方法能够决定突变体库中每个克通量筛选方法此方法能够决定突变体库中每个克隆的功能特性这种技术是当前惟一能够定量检测隆的功能特性。

这种技术是当前惟一能够定量检测单细胞水平和大量突变体酶催化活性的方法由于单细胞水平和大量突变体酶催化活性的方法由于在基因和它编码的蛋白质以及目的功能之间建立了在基因和它编码的蛋白质以及目的功能之间建立了一个直接连接，大容量蛋白质突变体库的筛选被大一个直接连接，大容量蛋白质突变体库的筛选被大大简化流式细胞仪结合细胞表面展示技术具有明大简化流式细胞仪结合细胞表面展示技术具有明显的优点：能够定量分析酶活性、同时测定多个参显的优点：能够定量分析酶活性、同时测定多个参数并且对每个观察到的克隆进行记录数并且对每个观察到的克隆进行记录  流式细胞术利用流式细胞仪对处在快速、直线、流流式细胞术利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术 流式细胞仪集激光流式细胞仪集激光技术、电子物理技技术、电子物理技术、光电测量技术术、光电测量技术计算机技术、细胞计算机技术、细胞荧光化学技术、单荧光化学技术、单克隆抗体技术为一克隆抗体技术为一体的一种新型高科体的一种新型高科技仪器。

技仪器 酵母细胞表面展示表达系统是一种固定化表达酵母细胞表面展示表达系统是一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统，即把异源靶蛋白基因异源蛋白质的真核展示系统，即把异源靶蛋白基因序列与特定的载体基因序列序列与特定的载体基因序列( (又叫定位序列又叫定位序列) )融合后融合后导入宿主细胞，利用酵母细胞内蛋白转运到膜表面导入宿主细胞，利用酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制使靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面与噬的机制使靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面与噬菌体和细菌细胞表面展示技术相比，酵母细胞表面菌体和细菌细胞表面展示技术相比，酵母细胞表面展示表达系统具有糖基化作用、蛋白翻译后折叠和展示表达系统具有糖基化作用、蛋白翻译后折叠和与哺乳动物类似的分泌机制的优势与哺乳动物类似的分泌机制的优势酵母表面展示酵母表面展示将蛋白分子编码序列与将蛋白分子编码序列与αα- -凝集素凝集素Ｃ端Ｃ端( (３２０个３２０个氨基酸残基，含有锚定信号序列氨基酸残基，含有锚定信号序列) )编码序列连接后编码序列连接后插入载体信号肽下游分泌表达，信号肽引导嵌合插入载体信号肽下游分泌表达，信号肽引导嵌合分子向细胞外分泌，而凝集素则锚定在酵母细胞分子向细胞外分泌，而凝集素则锚定在酵母细胞壁中，从而将酶分子展示表达。

壁中，从而将酶分子展示表达 a-a-凝集素凝集素由两对二硫键连接的Ａ由两对二硫键连接的Ａga1ga1基因编码基因编码的核心亚基的核心亚基( (７２５个氨基酸残基７２５个氨基酸残基) )和Ａ和Ａga2ga2基因基因编码的小结合亚基编码的小结合亚基( (６９个氨基酸残基６９个氨基酸残基) )组成a a凝集素的分泌蛋白凝集素的分泌蛋白AGA2AGA2通过两对二硫键与核心蛋通过两对二硫键与核心蛋白Ａ白ＡGA1GA1连接目的蛋白与结合亚基Ａ连接目的蛋白与结合亚基ＡGA2GA2的的C C末末端融合Ａ端融合ＡGA2GA2融合蛋白和Ａ融合蛋白和ＡGA1GA1在分泌途径中结在分泌途径中结合，并被转运到细胞表面后与细胞壁共价结合合，并被转运到细胞表面后与细胞壁共价结合 酵母展示系统应该满足以下几个条件：首先，表酵母展示系统应该满足以下几个条件：首先，表达偏差应该是最小的，以便达偏差应该是最小的，以便DNADNA库的多样性可代表正确库的多样性可代表正确折叠蛋白质的多样性；其次，要有定量筛选的标准；折叠蛋白质的多样性；其次，要有定量筛选的标准；最后，被选系统必须能很好的区分仅有微弱亲和力差最后，被选系统必须能很好的区分仅有微弱亲和力差别的突变体。

别的突变体 酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似，因而比原核细胞更能正确表达和展示人的蛋常相似，因而比原核细胞更能正确表达和展示人的蛋白质与噬菌体不同，酵母是个足够大的颗粒，可用白质与噬菌体不同，酵母是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪进行筛选和分离，这就使得基于特异定量流式细胞仪进行筛选和分离，这就使得基于特异定量亲和力改变的突变体分离成为可能由于酵母展示的亲和力改变的突变体分离成为可能由于酵母展示的蛋白质是紧密锚定在细胞壁上，可以耐受蛋白质是紧密锚定在细胞壁上，可以耐受SDSSDS等的抽提，等的抽提，同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具有很同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具有很好的应用前景好的应用前景 三、蛋白质分子定向进化的应用三、蛋白质分子定向进化的应用§ 提高酶分子的催化活力提高酶分子的催化活力§ 提高酶分子稳定性提高酶分子稳定性§ 提高酶分子对环境的适应能力提高酶分子对环境的适应能力§ 提高酶分子的对映体选择性提高酶分子的对映体选择性§ 变换催化反应专一性变换催化反应专一性。