假单胞菌pha降解苯酚的相关研究论文.doc

摘摘 要要 苯酚是工业排放废水中主要的有害污染物之一利用微生物修复含高浓度苯酚的土壤和水体是一种经济有效且无第二次污染的方法 近几十年的研究表明，许多微生物包括假单胞菌Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍｏｎａｓ．ｓｐ均参与了此类有机毒物的生物降解反应本研究从假单胞菌 Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍｏｎａｓ．ｓｐ 中筛选并得到了一新菌株 Ｐｈａ 经过鉴定证明该菌株能以苯酚为唯一碳源生长并通过诱导筛选使其苯酚选择压力从 ４００ｍｇ／Ｌ逐步提高到了 ７００ｍｇ／Ｌ 对羟化酶基因保守序列的 ＰＣＲ 检测 发现没有扩增到特异的保守条带推定其降解苯酚的生物途径可能不是羟化途径而是羧化途径测量其降解苯酚的曲线以此项研究为基础讨论了苯酚污水处理工艺设计的原则进一步用最小二乘法线性回归发现 Ｐｈａ 菌株降解苯酚的生物降解过程后部符合一级反应动力学方程在应用十二烷基磺酸钠ＳＤＳ作为增溶剂时发现在 ＳＤＳ 浓度为 ５０１５０ｍｇ／Ｌ 时 降解苯酚的速率随 ＳＤＳ 浓度增加而提高 ＳＤＳ 在低浓度时对菌株生长影响很小 但浓度达到 ３００ｍｇ／Ｌ 时，对其生长开始有了明显的抑制作用 由此得出 ＳＤＳ的理论最佳投放浓度为 １５０ｍｇ／Ｌ关键词关键词假单胞菌 ＳＤＳ 苯酚 生物降解 ＩＡｂｓｔｒａｃｔＡｂｓｔｒａｃｔ A newstrain ,named Pha, was domesticated from Pseudonomonas.sp StrainAB93188 by phenol selection. In order to obtain the expected strain the pressure appliedfor this selection is the high concentration of phenol with the ranges between 400mg/Land 700mg/L and selected bacterial strain has been proved to grow on the medium withphenol as sole carbon source.The degradation curve based on experimental data showedthat there is an inflexion in it. The possible reasons for the curve inflexion and correspondprinciple of phenol waste water treatment techniques have been discussed. In themeantime, the kinetic analysis for biodegradation has been programmed and the resultsshowed that the procedure accord with the first order kinetic model.To speed up thephenol degradation, SDS was added in the treatment phenol solution and the observationindicated that the addition of SDS fit the expectation of the experimental design. Howeverwhen the concentration of added SDS up to 300mg/L,the phenol degradation velocity wasdecreased.PCR analysing the genomic DNA isolated from the Pha strain no special bandof conservative sequence related to hydroxnase was founded.which indicated that thepossible path of phenol degradation may be carboxy path-way.Key words: SDS; phenol ; biodegradation; linear regressＩＩ独创性声明独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果尽我所知 除文中已经标明引用的内容外本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担学位论文作者签名日期年月日学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留使用学位论文的规定即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索可以采用影印本论文属于 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文保密在_____年解密后适用本授权书不保密请在以上方框内打学位论文作者签名指导教师签名日期年月日日期年月日１１ 文献综述文献综述 １１ ．． １１ 苯酚生产及含酚废水的危害苯酚生产及含酚废水的危害 苯酚俗称石炭酸，分子式为 Ｃ６Ｈ５ＯＨ，是一种芳香烃化合物． 苯酚是造纸炼焦炼油塑料农药 医药合成等行业生产的原料或中间体随着世界经济的飞速发展为满足工农业的需求全世界苯酚的生产和消费量分别由 １９９５ 年的 ５５７．３ 万和 ｔ５１３．１ 万 ｔ［１］，增长到 １９９９ 年的 ６６７．９ 万 ｔ 和 ５９７．０ 万 ｔ国内 １９９８ 年全年的产量也达到创纪录的 ２３．１ 万 ｔ且尚未包括进口的 ３．７２ 万 ｔ［１］工农业的繁荣发展带来苯酚的大量生产和消费 但由于污水处理的技术水平和成本等原因各类型的工厂如石油化工厂农药厂和电镀厂等均大量排出未经处理或处理未达标的污水其中酚类化合物是最常见的水体污染物［２］－［４］ 苯酚是工业排放废水中的主要有害成分含酚废水对人类的危害非常严重酚类是原生质剧毒物质 人体摄入一定量时可出现急性中毒症状长期饮用被酚污染的水可引起头晕 出疹搔痒贫血及各种神经系统症状苯的代谢产物主要在肝中氧化解毒和代谢从而对人的肝脏造成毒害渔业生产中如水中含低浓度的酚类时（Ｏ．１－０．２ｍｇ／Ｌ） 可使鱼的鱼肉有异味 高浓度（７０．５ｍｇ／Ｌ）时则造成中毒死亡含酚浓度高的废水不适于灌溉会使农作物枯死或减产甚至绝收 有研究发现 在 ５０１０ ６ 以上的浓度范围内 苯酚对水稻幼苗的生长有抑制作用，且随着浓度的增大 抑制作用更为严重 １５０１０ ６ 酚溶液处理后 ９ 天的水稻幼苗 其叶色枯黄生长几乎停止全部根系已变黑腐烂［５－６］由此可见１苯酚对动植物的污染和毒害是非常严重的 鉴于含酚废水对人类生存环境的的巨大威胁 美国环保署把苯酚列入优先污染物和 ６５ 种有毒污染物名单 我国也把苯酚列入中国环境优先污染物黑名单之中 为了达到经济有效地降解含酚废水 国内外学者对如何利用微生物清除废水中的酚及其衍生物已进行了大量的研究［７］－［９］ １１ ．． ２２ 处理苯酚的各种方法处理苯酚的各种方法 清除工业废水中酚的方法包括： １ 物理法萃取活性炭吸附 ２ 化学法化学氧化（如 ＴｉＯ２催化）和超声波裂解等 这些方法都有加入药品昂贵，易造成二次污染，或者设备维护复杂等缺点而利用微生物降解是一种经济有效且无二次污染的方法 １１ ．． ２２ ．． １１ 超声波法超声波法 超声降解废水的主要机制是声空化，强超声辐射进入废水溶液产生气泡，使水中原有微小泡核（附着在固体上的杂质微尘容器表面上或细缝中的微气泡）在超声负压和正压作用下急速膨胀和压缩，从而出现破裂和崩溃［１０］在液体内，超声强度大到一定程度会在液体中产生大量气泡，称为声空化泡这些气泡同时受超声作用，在经历声的稀疏相和压缩相时，气泡生长收缩，再生长再收缩，经多次周期震荡，最终在极短时间内崩裂５０００Ｋ）和高压（约 １０１３在其周期性震荡和崩裂过程中，会产生短暂的局部高温（约１０８Ｐａ），加热和冷却速率大于 １０１０ Ｋ／Ｓ，并产生强电场，从而引发许多热学化学等特殊效应［１１，１２］，即空化效应．空化效应产生局部高温高压，促使水分子产生 ＯＨ 和 Ｈ 自由基，这些含有未配对电子的自由基，直接氧化水溶液中的芳香族有机化合物，使之降解．同时一些非极性 易挥发有机废物的蒸气也会直接分解．声空化引起有机废水降解主要发生在 ３ 个区域，即空化气泡气相区 气液过渡区和本体液相区［１３，１４］（１）空化气泡气相区由空化气体水蒸气及易挥发有机溶质蒸气的混合２物组成，大部分自由基反应在此相进行（２）气液过渡区是围绕气相的一层很薄的超热液相层，含有挥发性有机废水，处于空化时的中间条件，存在高浓度的 ＯＨ 自由基，且呈超临界状态，极易发生非常规反应；（３）本体液相区基本处于环境条件，在前两个区域未被消耗的自由基，可继续在该条件下反应．如果在超声处理时加入无害环境的强氧化剂（如２２和３等），本体液相中会有较多的自由基或单电子氧化剂，使有机废物继续在此相中降解．有人将有机废水降解归结于空化 气泡崩灭促使传声媒质质点产生较大的瞬时速度和加速度［１５，１６］，从而引起剧烈振动，这种剧烈振动在宏观上表现出强大的液体剪切力，可使大分子主链上的碳键产生断裂，起到降解有机高分子的作用 王公正，吴胜举［１７］的研究表明，芳香族有机物苯酚易被超声释放到水中的自由基氧化，产生毒性小或易被生物降解的有机物中间体，并可进一步氧化分解成 ＣＯ２与 Ｈ２Ｏ等，从而使废水中有机碳下降，达到降解目的 加入无污染的强氧化剂，将加快降解速度 １１ ．． ３３ 苯酚降解菌的种类苯酚降解菌的种类 近几十年的研究表明许多微生物参与了此类有机毒物的具有重要环保意义的生物降解反应［１８２１］已分离鉴定的微生物包括根瘤菌（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）［２１］藻类（ａｌｇａ Ｏｃｈｒｏｍａｏｎａｓ）［４］ 酵 母 菌 （Ｙｅａｓｔ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）［２３］醋 酸 钙 不 动 杆 曲（Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）［３２－３４］假 单 胞 菌 （Ｐｓｅｕｄｏｎｏｍａｓ．ｓｐ）［３５－３７］真 养 产 碱 菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）［３０］．反硝化菌（Ｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ）［３１２１］等苯酚降解菌许多科学家对苯酚降解菌的功能特性和遗传机理进行了大量而深入的研究揭示了微生物降解苯酚的代谢途径中编码各类酶所需要的基因及其表达系统 ３１１ ．． ４４ 苯酚降解途径及相关基因苯酚降解途径及相关基因 １１ ．． ４４ ．． １１ 苯酚降解的生物途径苯酚降解的生物途径 １１ ．． ４４ ．． １１ ．． １１ 羟化酶途径羟化酶途径 如图 １ 所示，降解苯酚的代谢是将苯酚分解为邻苯二酚，邻苯二酚由邻位和间位途径经环裂解，最后形成三羧酸循环中间物邻位和间位途径是两个独立的代谢系统邻位途径产生酮基己二酸中间产物，间位途径产生 酮基己二酸中间物 １，苯酚；２，邻二苯酚；３，２－羟基粘糠酸半醛；４，２ 羟基粘酸；５，４－氧代己二酸（ 酮基己二酸）；６，２－ 氧代戊烯酸；７．己二酸；８．内脂；９．－ 酮基己二酸 ＨＯ：苯酚羟化酶；Ｃ２３Ｏ：邻苯二酚 ２，３ 加氧酶；Ｃ１２Ｏ：邻苯二酚 １，２－ 加氧酶；ＨＭＳＤ：２ 羟基粘糠酸脱氢酶；４－ＯＴ：４－氧代己二酸异构酶；４－ＯＤ：４ 氧代脱酸酶；ＬＥ：顺，顺 粘糠酸内酯酶［２］［１９］ 应该说大多数苯酚降解菌都是采取羟化途径，徐玉泉的研究通过比较不同种属苯酚降解菌的苯酚羟化酶大亚基的基因，发现它们有很高的同源性 根据多组分苯酚羟化酶基因的保守序列所设计的 ＰＣＲ 引物具有很高的特异性，在供试的所有苯酚降解菌中都能扩增出目的片。