4 动物源性食品中喹诺酮类药物测定的标准操作程序20150629--内标法.doc

动物源性食品中喹诺酮类药物测定的标准操作程序（LC/MS/MS 法）1.1 范围本操作程序规定了肉与肉制品、蛋与蛋制品、乳与乳制品及蜂产品中喹诺酮药物残留量检测的高效液相色谱一质谱/质谱检测方法本操作程序适用于猪肉、猪肝、猪肾、牛肉、羊肉、牛奶、鸡蛋、蜂蜜等食品中恩诺沙星、沙拉沙星、氟甲喹、双氟沙星、噁喹酸、达氟沙星 6 种喹诺酮类兽药残留量的液相色谱一质谱/质谱法测定和确证表 1 喹诺酮药物检出限和定量限喹诺酮药物恩诺沙星沙拉沙星达氟沙星双氟沙星氟甲喹 噁喹酸检出限(μg/kg) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5定量限(μg /kg) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.51.2 原理动物肌肉组织、肝脏、肾脏、牛奶、鸡蛋用 0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine 缓冲液 (pH4.0) 提取样品中的喹诺酮类抗生素，经过滤和离心后，上清液经 HLB固相萃取柱净化，高效液相色谱-质谱/质谱测定，同位素内标法定量蜂产品用氢氧化钠溶解后，离子化的喹诺酮类抗生素用 HLB 固相萃取柱净化，高效液相色谱-质谱/质谱测定，同位素内标法定量1.3 试剂除特殊注明外，本法所用试剂均为色谱纯，水为 GB/T6682 规定的一级水。

1.3.1 柠檬酸：分析纯1.3.2 磷酸氢二钠：分析纯1.3.3 甲醇：色谱纯1.3.4 乙腈：色谱纯1.3.5 甲醇一乙腈溶液：40+60（体积比） 1.3.6 甲酸(99%)1.3.7 氢氧化钠：分析纯1.3.8 乙二胺四乙酸二钠：分析纯1.3.9 氢氧化钠溶液（0.1mol/L）取 4g 氢氧化钠，溶解于 1L 水中1.3.10 磷酸氢二钠溶液：0.2 mol/L称取 71.63 g 磷酸氢二钠，用水溶解，定容至 1000 mL1.3.11 柠檬酸溶液：0.1mol/L称取 21.01g 柠檬酸，用水溶解，定容至 1000 mL1.3.12 Mcllvaine 缓冲溶液：将 1000mL0.1mol/L 柠檬酸溶液(4.3.10)) 与 625 mL0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液 4.3.9)混合，必要时用盐酸或氢氧化钠调节 pH 至4.0 士 0.051.3.13 EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液： 0.1mol/L称取 60.5g 乙二胺四乙酸二钠（4.3.8）放人 1625mLMcllvaine 缓冲溶液(4.3.11)中，振摇使其溶解1.3.14 甲醇水溶液：5%( 体积分数)。

1.3.15 甲酸水溶液：0.2%(体积分数)1.3.16 喹诺酮类药物标准物质：恩诺沙星（enrofloxacin，CAS：93106-60-6） 、双氟沙星（ difloxacin hydrochhride ，CAS：82419-36-1） 、沙拉沙星(sarafloxacin，CAS：98105-99-8) 、氟甲喹 (flumequinc，CAS：42835-25-6) 、噁奎酸（oxolinic acid，CAS ：14698-29-4 ) 、达氟沙星(Danofloxacin，CAS：112398-08-0 )纯度>99%)、恩诺沙星-D5 （enrofloxacin-d5，CAS：93106-60-6） 、噁喹酸-D5 （Oxolinic acid-d5 CAS：O857502） 1.3.17 标准溶液1.3.17.1 标准储备液： 分别称取 0.0100 g 标准品 (1.3.15)置于 10mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，标准储备液浓度为 1mg/mL，-20℃冰箱中保存，有效期 3 个月1.3.17.2 标准工作液：将以上各标准储备液(1.3.16.1)稀释，配成混合标准溶液。

各组分浓度为 10μg/mL，此标准工作液于 4℃保存，可保存 3 个月1.3.17.3 同位素内标储备液：分别称取 0.001g 同位素内标标准品 (1.3.15)置于10mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，标准储备液浓度为100μg/mL，-20℃冰箱中保存，有效期 3 个月1.3.17.4 混合内标应用液（1μg/mL ）：分别移取恩诺沙星-D5、噁喹酸-D5 液体标准品（100μg/mL）各 100μL，用甲醇定容至 10mL，混匀1.3.17.5 混合标准系列：准确移取适量混合标准应用液（1.3.17.2）和混合内标应用液（1.3.17.4） ，用 0.2%甲酸水溶液配制成2.5μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L 、60μg/L、80μg/L、100μg/L 的混合标准系列，每份溶液含 5.0μg/L 的混合内标 （恩诺沙星、双氟沙星、沙拉沙星、达氟沙星用恩诺沙星-D5 校准，氟甲喹、噁喹酸用噁喹酸-D5 校准）1.4 仪器与耗材1.4.1 超高效液相色谱-串联质谱仪；1.4.2 电子天平：感量 0.0001g；1.4.3 电子天平：感量 0.01g；1.4.4 组织匀浆机；1.4.5 旋涡混合器；1.4.6 冷冻离心机(最高转速大于 10000r/min)；1.4.7 康宁聚丙烯离心管(50 ml)；1.4.8 酸度计（0.01） ；1.4.9 氮吹仪；1.4.10 固相萃取仪；1.4.11 HLB 固相萃取柱(200 mg/6mL)或其他等效柱1.5 操作步骤1.5.1 样品制备制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化。

1.5.1.1 动物肌肉和动物内脏将现场采集的样品放入小型冷冻箱中运输到实验室，在-10℃以下保存，一周内进行处理取适量新鲜或冷冻解冻的动物组织样品去筋、捣碎均匀1.5.1.2 牛奶 将现场采集的样品放入小型冷冻箱中运输到实验室，在-10℃下保存，一周内进行处理取适量新鲜或冷冻解冻的样品混合均匀1.5.1.3 鸡蛋将现场采集的样品放人小型冷冻箱中运输到实验室，在-10℃以下保存，一周内进行处理取适量新鲜的样品，去壳后混合均匀1.5.1.4 蜂产品将现场采集的样品放人小型冷藏箱中运输到实验室，在-4℃以下保存，一周内进行处理1.5.2 提取1.5.2.1 动物肌肉组织、肝脏、肾脏称取均质试样 5. 0 g(精确到 0.01g)，置于 50 mL 聚丙烯离心管中，加人20mL0.1 mo1/L EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液（1.3.12） ，1000r/min 旋涡混合1min，超声提取 10min，10000r/min 离心 5min（温度低于 5℃） ，提取两次，合并上清液，上清液用玻璃纤维滤纸过滤，用缓冲液（1.3.12）定容至 40mL，待净化1.5.2.2 牛奶 称取均质试样 5.0g(精确到 0.01g)，置于 50 mL 聚丙烯离心管中，用 40mL 1mol/L EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液（1.3.12）溶解，1000 r/min 旋涡混合 1min，超声提取 10min，10000 r/min 离心 10min（温度低于 5℃） ，上清液用玻璃纤维滤纸过滤后，用缓冲液（1.3.12）定容至 40mL，待净化。

1.5.2.3 鸡蛋称取均质试样 2.0g(精确到 0.01g)，置于 50 mL.聚丙烯离心管中，用20mL0.1mol/L EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液（1.3.12）和 10mL 乙腈溶解，1000 r/min 旋涡混合 1min，超声提取 10min，10000 r/min 离心 10min（温度低于 5℃），取上清液 15mL 待净化1.5.2.4 蜂产品称取均质试样 5.0g(精确到 0.01g)，置于 50 mL 聚丙烯离心管中，加入 5mL氢氧化钠溶液（1.3.9）溶解，1000 r/min 旋涡混合 1min，超声提取10min，10000 r/min 离心 10min（温度低于 5℃） ，上清液转移另一离心管中，重复提取 1 次，合并上清液，提取液中加入 10mL 正己烷，震荡 5min，10000 r/min 离心 10min（温度低于 5℃） ，弃上清，再加入 10mL 正己烷震荡，离心，弃上清，下层备用液待净化1.5. 3 净化HLB 固相萃取柱(200 mg/6 mL)，使用时用 6 mL 甲醇洗涤、6 rnL 水活化将 1.5.2.提取的溶液以 2 mL/min~3mL/min 的速度过柱，弃去滤液，用 2 mL 5%甲醇水溶液(1.3.13) 淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干，再用 6mL 甲醇洗脱并收集洗脱液。

洗脱液在 40℃~50℃下氮气吹干，用 1mL 0.2%甲酸水溶液(1.3.14)溶解，1000 r/min 旋涡混合 1 min，用于上机测定1.5.4 高效液相色谱一质谱/质谱测定1.5.4.1 高效液相色谱条件1.5.4.1.1 色谱柱：安捷伦 C18 柱(100 mrn*2 .1 mm，1.8μm)或其他等效柱；流速：0.25mL/min；柱温：40℃；进样体积：10μL1.5.4.1.2 流动相：A [40+60 甲醇-乙腈溶液]；B [0.2%甲酸水溶液]梯度淋洗，参考梯度条件见下表 2表 2 液相色谱参考条件时间 /min 甲醇 -乙腈 /% 0.2%甲酸水 /%0 10 905 60 407 80 2010 100 012 10 9015 10 901.5.4.3 6 种喹诺酮的提取离子色谱图见，图 1图 1：6 种喹诺酮的提取离子色谱图1.5.5 质谱条件a）电离源:ESI +；b）毛细管电压：3.0 kV；c）射频透镜电压： 0V；d）源温度度：300℃；e）干燥气温度： 350℃；f）干燥气流量：12 L/min；h）雾化器压力：35psi；质谱扫描方式：多反应监测离子（MRM）见表 3； 表 3 6 种喹诺酮的质谱参数化合物 母离子 子离子 碰撞电压/eV 碎裂电压/V315.9* 15 130恩诺沙星 360.1342.3 20 130341.9* 20 135沙拉沙星 386.1298.9 20 135243.8* 18 95氟甲喹 262.1201.9 28 95340* 19 95达氟沙星 358.181.8 38 95356.1* 20 125双氟沙星 400.1382.1 20 125243.9* 12 100噁喹酸 262.1216.2 10 100347.2* 26 125恩诺沙星-D5 365.1320.8 15 125噁喹酸-D5 267.1 248.9* 15 100134.8 32 1001.5.6 液相色谱－质谱确证在上述液相色谱－串联质谱条件下进行测定。

试液中待测物的保留时间应在校正溶液保留时间的时间窗内，各离子对的相对丰度应与校正溶液的相对丰度一致，误差不超过表 3 中规定的范围表 3 定性时相对离子风度的最大偏差相对离子丰度/% ﹥50 50～ 20 ﹥20 ～ 10 ﹤10允许的相对误差/% ±20 ±25 ±30 ±501.6 计算按下式计算喹诺酮类药物残留量10cVXm式中:x—样品中待测组分的含量，单位为微克每千克（µg/kg） ；c—测定液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL) ；V—定容体积，单位为毫升(mL)；m—样品称样量，单位为克（g）：1.7 方法精密度及回收率添加浓度在 0.5～20.0µg/kg 时，6 种喹诺酮药物在不同的食品类别中回收率范围在 65.4%～116.1% 之间，方法相对标准偏差小于 20%，在 2.5 ng/mL 到100.0 ng/mL 范围内，线性良好，6 种喹诺酮药物的相关系数 r2≥0.995 回收率实验采用三个加标浓度，6 种喹诺酮药物在不同基质中的加标回收率见表 4表 4 6 种喹诺酮药物的回收率化合物 鸡肉（%）猪、牛、羊肉（%）鸡蛋（%）蜂制品（%）乳及乳制品（%）恩诺。